Burnet和Thomas首先提出免疫监视功能，即免疫系统能够发现并抑制肿瘤的生长和发展。但是肿瘤往往能够冲破这种免疫系统的监视而发生免疫逃逸而生长起来。关于肿瘤免疫逃逸的机制的研究已有很多报道，总结起来大致分为两方面：1)肿瘤诱导荷瘤机体免疫系统功能紊乱；2)肿瘤细胞自身细胞变异来主动地逃避免疫系统的攻击。这些肿瘤的变异体或者丢失一些对于免疫应答起重要作用的表型(例如MHC Ⅰ分子)，或者表达一些蛋白质来加速肿瘤的生长并抑制肿瘤的凋亡。 参与肿瘤免疫的免疫细胞主要有T细胞，NK细胞和抗原提呈细胞(APC)。已有的报道表明，与肿瘤细胞相互作用可以抑制这些免疫细胞包括树突状细胞(DC)的免疫激发功能，并且在肿瘤的局部抑制DC细胞的功能，并使其数量减少。肿瘤局部分泌的抑制性因子能够抑制B细胞，甚至是T细胞的功能。人们已经从肿瘤的培养上清中检测出了多种免疫抑制性因子(如TGF-β，IL-10，VEGF)，它们可能与肿瘤的免疫逃避有关。 Exosomes是直径在30-90nm之间的一类膜性囊泡，首先在细胞系的培养上清中被发现，并由网织红细胞的培养上清中纯化而得到命名。现在发现，大多数细胞如网织红细胞、B细胞、T细胞、DC、肥大细胞和一些肿瘤细胞等等能够分泌Exosomes。但是对于Exosomes的生物学功能仍然不十分清楚。目前的研究表明，Exosomes的生物学功能可能与以下生命现象有关：1)丢弃细胞内的废物(如网织红细胞在成熟过程中丢弃TfR)，2)作为细胞间细胞膜交换的中介或者在细胞间传递信号，3)Exosomes还可以作为APC或疫苗来诱导抗原特异性免疫应答反应，4)Exosomes可能与逆转录病毒的感染有关。Exosomes是否具有其它新的功能?肿瘤来源的Exosomes除了能够诱导抗肿瘤免疫应答反应外，是否与肿瘤免疫逃逸有关，其功能与其不同的组织和细胞来源是否有关?我们通过本实验在此方面进行了探索。 1998年，法国学者Zitvogel L等用DC来源的Exosomes治疗肿瘤，发现能够消除已经发生的肿瘤。自此，科学家们开始重视Exosomes并致力于Exosomes作为肿瘤疫苗的研究。这些研究大多以DC来源的或者肿瘤细胞冲击过的DC来源的ExoS。mes为研究对象。但是，也有文献提示ExosomeS也可能在免疫耐受中起重要作用。例如，人小肠上皮细胞(IEC)分泌的ExoS0mes中，基础状态下即有MHC工类分子、CD26、CD63分子的表达，在炎症状态下，MHCH分子表达大量增加。有人对大鼠IEC分泌的ExosomeS的实验提示，Exosomes能够诱导口服耐受，而且这种耐受状态还可以通过ExosomeS过继转移。尽管如此，另外学者通过对小鼠工EC的研究提出相反的结论，即小鼠工EC分泌的ExosomeS可以诱导强烈的免疫应答反应。那么，到底是各自的实验体系的问题呢还是物种的不同所致呢，目前尚不得而知。 最近，有人用HLA一G阳性的肿瘤细胞株培养分离ExosomeS，发现该种ExosomeS有HLA一G存在，并且用HLA一GI CDNA转染不表达HLA一G的细胞系后分泌的ExosomeS同样有HLA一G的表达。我们已经知道，HLA一G与免疫耐受有关，因而携带有HLA一G的ExoS0mes可能提供免疫耐受的调节信号。有趣的是，有人用供者BMDC来源的ExosomeS预处理受者，然后进行小鼠的同种异体心脏移植，发现能够明显地延长移植物的存活时间并明显地减轻白细胞的浸润，进一步提示ExoS0mes可能会参与免疫耐受的形成。 根据以上资料，我们提出一个假说:肿瘤组织分泌的ExosomeS可能会参与肿瘤的免疫逃逸。为此，我们以一种C57BL/6来源的3LL Lewis肺癌细胞系建立模型，用3LL细胞系和3LL肿瘤组织分泌的ExosomeS进行了体内和体外的功能实验，并从T细胞免疫应答的角度初步探讨了其作用的机制。模型的建立和Exosomes的分离与纯化 我们利用一种C57BL/6小鼠的3LL LewiS肺癌细胞系作模型，将3LL细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，待3周时无菌取出肿瘤组织，剪碎后用DMEM加10%的血清在37℃，5%的CZO中培养，30小时后收集培养上清。然后用梯度离心的方法纯化分离ExoS0mes。3LLLewiS肺癌细胞系的细胞在培养30小时后也取培养上清分离纯化Ex0SomeS。为了使所分离的ExosomeS中尽量减少杂蛋白和小牛血清中的Exosomes的影响，我们在培养之前，先把小牛血清用100，0009预离心过夜，并且细胞培养上清超离分离到的沉淀物用PBS反复洗涤离心两次，然后再用蔗糖进行密度梯度离心，收集1.12一1.199/ml之间的成分，以尽量使之纯化。Exosomes的形态学电镜观察 我们将蔗糖分离后的沉淀物用电镜进行分析，可见所得的沉淀物为30一gonm的膜性囊泡构成，这些膜性囊泡都呈碟型。在细胞系来源的ExoS0mes和肿瘤组织来源的ExosomeS之间的电镜结构没有观察到明显的区别。肿瘤组织来源的Exosomes对T细胞增殖反应的体外抑制作用 T细胞是构成肿瘤免疫的主要效应细胞，研制肿瘤疫苗以激发免疫功能或者肿瘤细胞逃逸免疫功能的监视都直接或者间接地与T细胞免疫功能有关，因此本研究首先着眼于肿瘤组织来源的ExosomeS与T细胞功能的关系。 1.肿瘤组织来源的Exosomes抑制丝裂原诱导的T细胞的增殖反