[背景]肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤。ACC占恶性肿瘤的0.02%。ACC恶性程度高,侵袭性强,早期诊断困难,目前对其发生的病理学机制仍不明确,生物学方面早期容易出现转移和复发,平均生存期18个月。肾上腺皮质癌的组织结构与形态和肾上腺皮质腺瘤类似,且临床上并非大体积肾上腺病变都会表现为癌的生物学行为,一些在组织学上看似良性的病变最后却发生了转移；在没有组织浸润或转移征象时,病理学鉴别ACC与良性肾上腺皮质腺瘤较为困难。ACC治疗仍以根治手术为主,缺乏有效的药物治疗,易发生远处转移,术后复发率高,预后差。尽管目前有各种先进的影像学诊断方法、分子生物学技术及治疗手段,但对原发性恶性肾上腺肿瘤仍然难以诊断和处理。ACC因基因的不稳定(或存在尚未发现的靶基因)产生克隆进化及免疫逃避,是其治疗疗效欠佳的直接原因。从ACC病因研究中,筛选影响其患病的遗传风险因素,深入探索其发生、发展的相关机制,有利于为ACC早期诊断、有效的治疗和预防奠定理论基础。克隆研究显示基因改变在肾上腺皮质肿瘤发生中具有重要作用,已发现不同位点或染色体区域及基因与ACC的发生有关。ACC的分子机理未明,可能与抑癌基因的失活(TP53、Men-1、P57Kip2、H19)、原癌基因(Gas、Ras、ACTH受体缺失)以及生长因子IGF-2的过度表达有关。。肾上腺皮质肿瘤良恶性鉴别困难,应进一步研究其发病的分子机制,发现更为有效的分子水平诊断靶点。microRNAs是一类由19-25个核苷酸组成的非编码小分子单链RNA,广泛存在于植物、线虫到人类的细胞中。第一个microRNA (Lin-4)是在研究线虫发育的遗传筛选中发现的,它能通过与Lin-14mRNA的3’UTR的部分互补结合来抑制其蛋白的翻译。microRNAs真正进入研究人员视野的是第二个microRNA(Let-7)被发现,Let-7除了可以抑制靶基因的表达,更重要是Let-7在不同物种之间为高度保守。近年来发现Lin-4、Let-7及随后的众多microRNAs,均在生物体内基因调控网络中起重要作用。RNA-pol Ⅱ将microRNAs的编码基因转录为pri-microRNAs, pri-microRNAs进一步自我折叠成一个约60-80nt的发夹状茎环结构；在细胞核内,此发夹结构又被microprocessor复合体识别和剪切,形成pre-microRN As。 RNase核酸酶Drosha在microprocessor复合体中起剪切作用,其辅助因子为DGCR8蛋白。细胞核中的pre-microRNAs在受体蛋白Exportin-5和Ran-GTP的协同作用下转运到细胞质中,然后在Dicer酶和其辅因子TRBP共同作用下释放成熟的microRNAs。由于nicroRNAs在生物体发育和分化过程中对基因表达调控起到了广泛而且是至关重要的作用,而肿瘤往往是由于某些基因紊乱或是表达失控所引起的,因此,许多研究人员开始研究microRNAs和肿瘤发生之间的关系。Takamizawa等在2004年第一个报道了miRNA-let-7(let-7)在非小细胞肺癌患者中显著降低；lorio等发现在乳腺癌患者中miRNA-145、miRNA-9-3明显下调,提示miRNA-145、 miRNA-9-3的正常表达可能有抑制肿瘤的作用。人们还发现在人类B细胞淋巴瘤中miRNA-155表达普遍增高,研究进一步发现miRNA-155能直接下调抑制因子(如MAD1、MXI1、ROX/MNT等)的表达,增强myc基因的活性,导致细胞发生癌变。若干microRNAs在多种肿瘤组织中的表达水平有不同程度上调或下调,这一现象初步揭示了肿瘤发生与microRNAs表达之间存在相关性。近年来microRNAs在肿瘤中的异常表达及其作用机制阐明,为肿瘤发生、发展提供了重要理论依据,为肿瘤临床诊疗工作带来新的希望。microRNAs在ACC中的作用也正受到人们的关注,Tombol等应用nicroRNAs芯片技术初步发现在ACC组织中多个microRNAs的表达高于正常水平(miR-184、 miR-503),多个microRNAs的表达低于正常水平(miR-511、miR-214),其下游涉及G2/M信号通路的破坏,并发现miR-26b的表达可能与ACC的临床分期相关。Soon等发现miR-195、miR-335在ACC中明显低表达,miR-483-5p显著高表达,同时具有miR-483-5p高表达、miR-195低表达的ACC患者,则有着更低的肿瘤特异性生存期。多项研究表明：miR-205在头颈癌、卵巢癌及乳腺癌中高表达,与浸润性磷状细胞癌(squamous cell carcinoma)预后相关。miR-205可通过磷酸化Akt,靶定JPH4基因等,抑制癌细胞凋亡,从而在肿瘤发生、发展中起重要作用。但亦有研究表明,miR-205作为肿瘤抑制基因,通过靶向HER3抑制乳腺癌发生,通过抑制上皮-间质转换,抑制癌细胞迁移／浸润,抑制癌进展。通过三个软件预测(MIRANDA, TARGETSCAN and PICTAR-VERT), miR-205的可能靶基因有228个,包括E-cadherin、ErbB3、N-chimaerin、E2F1、E2F5、protein kinase Cepsilon LRP1、interleukin6、caveolin-1、EZH2等,文献报道证实miR-205靶基因有VEGF-A、HER3、JPH4、ZEB1等。本课题组在137例ACC患者多因素Cox风险模形表明：PCAF与肾上腺皮质癌预后相关,通过软件PicTar (http://pictar.bio.nyu. Edu)、TargetScans (http://www.targetscan.org)预测到PCAF亦是miR-205的靶基因之一,进一步预测分析发现,miR-205和PCAF基因mRNA3’UTR碱基(含3351C/T)为互补配对。前期预实验发现,miR-205在ACC病理组织中表达明显低于肾上腺皮质腺瘤及正常肾上腺组织,推测miR-205在ACC中作为抑癌基因在其发生及发展中发挥作用。[目的]查阅最新文献,miR-205与肾上腺皮质癌之间的研究国内外未见报道。本研究首先构建了pcDNA3.1(+)-miR-205真核表达载体及合成miR-205反义核苷酸,调控SW-13细胞中miR-205表达,观察其对肾上腺皮质癌SW-13细胞增殖、凋亡和侵袭等影响。本研究有可能为ACC的发病机制及诊疗策略进一步提供新的思路和理论依据。[方法]1.采用组织芯片平台,原位杂交技术检测ACC、肾上腺腺瘤及其正常对照组织中miR-205表达水平。2.通过基因重组技术构建pcDNA3.1(+)-miR-205重组质粒,通过Lipofectamine2000将pcDNA3.1(+)-miR-205转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,上调miR-205在SW-13中的表达。合成miR-205的反义寡核苷酸并转染SW-13细胞,下调miR-205在SW-13细胞中表达。实时荧光定量PCR法验证miR-205在SW-13细胞中调控后表达水平。3.在上调和下调miR-205表达后,观察在ACC细胞株中细胞水平的功能研究：通过MTS、EdU实验观察细胞增殖；用PI标记流式细胞仪测量细胞周期；TUNEL染色标记凋亡细胞；划痕试验法观察细胞迁移能力；Transwell法观察细胞侵袭能力。[结果]1.原位杂交试验结果表明,miR-205在ACC中表达明显低于肾上腺腺瘤组织及正常对照组织,miR-205在ACC、肾上腺腺瘤组织及正常对照组织中阳性率分别为26.6%、84.5%及90.8%,其表达差异有统计学意义(P<0.05)。2.实时荧光PCR提示,在转染pcDNA3.1(+)-miR-205及miR-205反义寡核苷酸后,SW-13细胞中miR-205分别上调了63.2倍(P=0.001)及下调了86.3%(P=0.002)。miR-205mRNA的表达量差异说明：SW-13细胞中已成功转染miR-205真核表达质粒和miR-205反义核苷酸。3.在肾上腺皮质癌SW-13细胞株中,上调或下调miR-205表达后,分别采用MTS、EdU、TUNNEL及Transwell小室法,检测过表达及抑制miR-205对SW-13细胞生物学行为的影响。MTS结果提示,在24、48、72和96h时pcDNA3.1(+)-miR-205组相对于pcDNA3.1(+)组,SW-13细胞增殖抑制率分别为(10.50±1.8)%,(23.67±4.8)%,(30.79±5.4)%和(38.34±6.2)%,P值分别为0.041,0.014,0.016及0.032；而anti-miR-205转染组SW-13细胞增殖速度明显快于空白对照组,在不同的时间段,增殖率分别提高了(25.31±3.2)%,(32.51±4.6)%,(40.15±4.1)%和(38.34±6.2)%,P值分别为0.032,0.026,0.022及0.013。EdU结果显示,pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组增殖率分别为(18±2)%和(36±4)%, P=0.002; anti-miR-205组和空白对照组增殖率为(49±5)%和(38±4)%,p=0.04; EdU检测细胞增殖结果进一步证实miR-205能够抑制SW-13细胞增殖。上调或下调miR-205表达后,流式细胞仪检测结果提示SW-13细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期差异均有统计学意义(P<0.05)。TUNNEL检测pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组相比,SW-13细胞的凋亡数分别为(46±4)／视野和(25±3)／视野,P=0.0019；而anti-miR-205组相对空白对照组的凋亡数为(11±2)／视野和(24±3)／视野,P=0.0033,结果提示miR-205促进ACC SW-13细胞株的凋亡。划痕实验结果提示,在6h、24h、48h时,pcDNA3.1(+)-miR-205组SW-13细胞迁移率为7.04%、33.93%和52.37%；pcDNA3.1(+)组为9.36%、44.82%和73.90%；anti-miR-205组为17.50%、68.52%和99.06%；空白对照组为12.17%、39.00%和72.02%. Transwell小室检测pcDNA3.1(+)-miR-205组与pcDNA3.1(+)组穿过小室膜数分别为(43±8)／视野和(120±15)／视野,P-0.0014; anti-miR-205组和空白对照组则分别为(120±15)/视野和(220±20)／视野,P=0.0019；结果提示miR-205能够增强ACC SW-13细胞株的迁移和侵袭能力。[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,为进一步研究miR-205在肿瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。miR-205通过抑制SW-13细胞的增殖、侵袭能力,促进其凋亡改变等,发挥抑癌作用。miR-205有可能成为鉴别ACC和良性肾上腺皮质腺瘤的一个分子标记物,进而可能成为ACC生物治疗靶点提供依据。