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第一部分脊索样髓核细胞的分离提取目的:分别通过percoll密度梯度离心法以及细胞筛法分离并培养大鼠尾椎来源的脊索样髓核细胞,通过形态学手段观察鉴定脊索样髓核细胞,比较两种技术分离脊索样髓核细胞方法的效率,为下一步细胞学分析鉴定实验基础。方法:取4周龄的SD大鼠30只,随机分成无筛组、percoll密度梯度离心组与细胞筛组。取大鼠尾椎髓核组织,分别通过无筛组、percoll密度梯度离心法与细胞筛法分离出髓核细胞。光镜下观察各组方法下细胞形态学标记并分类计数,透射电镜下观察脊索样髓核细胞形态。结果:无筛组提取细胞总数较多(p<0.05),有“液泡”结构细胞/视野下细胞总数比例低于两种筛选提取法(p<0.05)。percoll组提取的有“液泡”结构的细胞较细胞筛组更多(p<0.05),percoll组提取的细胞总数也高于细胞筛组(p<0.05)。percoll组下观察到有“液泡”结构细胞/视野下细胞总数的比例与细胞筛法无明显统计学差异(p>0.05)。电镜可见脊索样髓核细胞多为20-30μm大小,细胞胞浆内富含大小不等的各类空泡,是一种由不完整的胞浆单层胞膜包裹的亚细胞结构,在胞膜不连贯的区域内胞浆成份向空泡内疝入。结论:经过percoll密度梯度离心法,可以更有效地提取脊索样髓核细胞。为下一步细胞学实验鉴定实验基础第二部分内体抑制剂及培养时间对脊索样髓核细胞内空泡形态的影响目的:观察内体抑制剂Brefeldin A(BFA)对脊索样髓核细胞胞内空泡结构影响,对比不同培养时间下脊索样髓核细胞与软样髓核细胞内体相关蛋白的表达变化。方法:取三组接种4天的脊索样髓核细胞,分BFA组,空白组与对照组,分别给予5μg/μl BFA,等体积二甲基亚砜与培养液,培养4h后观察细胞形态。观察正常条件下培养4d、7d的脊索样髓核细胞与培养7d的软骨样髓核细胞,并使用western blot技术检测细胞内内体转运相关的Rab5、Rab32、Lampl、Lamp2的表达情况。结果:对比于空白组与对照组,BFA组细胞内空泡面积减少(p<0.05)。培养4d的脊索样髓核细胞中Rab32的表达量较培养7d的脊索样髓核细胞与软骨样髓核细胞组更多(P<0.05)。培养4d、7d的脊索样髓核细胞中lamp1的表达量较软骨样髓核细胞组更多(P<0.05)。培养4d的脊索样髓核细胞中lamp2与Rab5的表达量较其余组更少(P<0.05)。结论:内体系统参与脊索样髓核细胞内空泡的表达,长培养时间脊索样髓核细胞表现为去空泡化变化。第三部分不同条件下脊索样髓核细胞内内体转运相关蛋白的表达变化目的:研究干扰RAB32基因、弱酸性、营养匮乏及机械损伤四种因素对脊索细胞内体转运相关蛋白表达的影响,探讨脊索样髓核细胞退变与细胞的内体转运系统的联系。方法:使用RNA干扰技术干扰Rab32在脊索样髓核细胞内的表达,用荧光显微镜观察转染效率。利用western blot方法检测机械损伤、酸性环境、营养匮乏、siRab32转染以及长短时间培养的脊索细胞以及软骨样髓核细胞内内体转运相关的Rab5、Rab32、Lamp1、Lamp2的表达情况,并使用光镜下观察各组细胞形态学变化。结果:Real-timePCR技术检测,si-rab32组表达mRNA显著低于空白组与阴性对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光技术显示Si-rab32转染后阳性细胞比例大于空白对照组(P<0.05)。Western Blot法检测结果显示:在机械损伤、弱酸性环境与干扰Rab32时,髓核细胞Rab32、Lamp1蛋白表达与正常处理组比较显著减低(p<0.05),而Lamp2、Rab5蛋白表达与正常处理组比较显著增高(p<0.05)。营养匮乏时髓核细胞Rab32、Lamp1蛋白表达与正常处理组比较显著减低(p<0.05),而Lamp2显著增高(p<0.05)Rab5蛋白表达未见明显差异(p>0.05)结论:不同环境条件及干扰Rab32表达的情况下髓核细胞内内体转运相关蛋白的表达会发生变化,内体转运系统的调控可能与髓核细胞的退变存在联系。