论文部分内容阅读
银杏（Ginkgo biloba L.）是现存最古老的裸子植物之一,银杏种子具有重要的经济价值,但银杏种子休眠过程和休眠解除机理还不清楚。本论文以刚采收的银杏种子（9月份）、休眠中期种子（11月份）以及解除休眠（次年2月份）的种子为试验材料,分别对银杏种胚不同发育时期进行形态观察,尝试不同层积方式处理解除银杏种子休眠,对银杏种胚、胚乳进行植物内源激素含量测定,并利用高通量测序技术和生物信息学方法,深入研究银杏种子休眠过程与休眠解除。主要取得以下研究结果:（1）定期拍摄9月份至次年2月份的银杏种胚长度及测定种胚重量发现,银杏种胚的长度和重量呈正比例上升趋势,9月种子成熟采收至10月,银杏种胚形态发育缓慢,胚较小约0.78 cm,其组织结构不明显。到11-12月种胚开始迅速生长,平均长度1.2 cm左右,形态变化明显,已发育形成较为完整的胚根、胚轴、胚芽和子叶。到次年2月种胚形态发育基本完成,子叶仍在生长。（2）通过不同层积方式解除银杏种子休眠发现,室外自然沙藏层积中,随着层积时间增长,种子萌发率逐渐提高,但到层积90 d和层积100 d种子萌发率相近,其中层积100 d达到42.9%,比对照组（干藏种子）35.77%高了 19.93%。4℃低温层积4周后统计结果显示,层积50 d和60 d的种子萌发率相近,分别为36%和35.5%;而层积40 d的种子萌发率与对照组（低温干藏）相比差别不大,约26.5%。说明50 d以上的4℃低温层积可以提高种子萌发率。相比室外自然层积,4℃低温层积处理可缩短种子休眠时间。（3）利用串联质谱仪分别对银杏种子休眠过程中的内源激素进行测定,结果发现种胚中的ABA在3个休眠阶段整体含量都较高,尤其11月种胚ABA相对含量最高,约570 ng.g-1,到2月出现明显下降,约为365.6 ng.g-1;种子休眠过程中的GA含量整体较低,9月种胚中的GA相对含量最低,约5.8ng.g-1,到2月种胚GA相对含量呈显著上升趋势,达到10.94 ng.g’1;说明ABA在银杏种子休眠过程中起到主要维持休眠的作用。（4）在 9 月（GES）、11 月（GEN）、2 月（GEF）种胚中分别获得 13,292,093、13,404,160、14,141,212条原始序列,去除无插入片段、小于18nt短序列、polyA序列等低质量序列,最终得到12,749,995、13,026,297、13,664,058条高质量序列。文库中小RNA长度集中在18-24nt之间,在21、24nt处有峰值,符合典型miRNA长度分布。（5）测序获得保守序列256条,比对miRBase数据库后,隶属49个miRNA家族。其中,miR156、miR159家族成员较多。预测获得198个新的miRNA,具有发夹结构。此外,以qvalue<0.01&| log2（foldchange）|>1为标准,筛选差异表达的miRNA,共筛选出415个差异miRNA。通过9月、11月、2月种胚3个数据库比对,以9月为参照,11月vs9月（GEN vs GES）,筛选出90个差异miRNA;2月vs9月（GEF vs GES）,筛选出174个差异miRNA;以11月为参照,2月vs 11月（GEF vs GEN）,筛选出151个差异miRNA。（6）应用psRNATarget软件,对银杏种胚差异miRNA进行靶基因预测,已知miRNA预测得到1710个靶基因,新的miRNA预测得到1168个靶基因。通过GO富集分析发现,2月vs 9月（GEF vs GES）差异miRNA的候选靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能上都有注释;11月vs 9月（GEN vs GES）差异miRNA的靶基因在生物学过程、分子功能上有注释;2月vs 11月（GEFvsGEN）差异miRNA的靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能上都有注释。通过KEGG富集发现,2月vs 9月（GEF vs GES）差异miRNA的靶基因主要富集在生物合成、植物激素信号转导等途径;11月vs 9月（GEN vs GES）差异miRNA的靶基因主要富集在代谢通路、植物激素信号转导等途径;2月vs 11月（GEF vs GEN）差异miRNA的靶基因主要富集在生物合成、代谢等途径。（7）基于以上对种胚休眠差异miRNA及其靶基因富集分析,并结合银杏基因组和种胚转录组数据以及靶基因功能注释,进一步重点分析种胚发育和激素信号相关miRNAs在不同休眠阶段的表达模式。其中,与种胚发育相关miRNAs,如miR156家族的表达水平较高,miR156a先下降后上升,miR156b整体呈上升趋势,表达水平都在2月最高。miR156的预测靶基因为Gb27198（功能注释为SPL基因）在种胚3个休眠阶段表达水平呈下降趋势,与miR156b的表达模式相反。与激素信号相关miRNAs,如miR159家族在种胚休眠前两个阶段变化不大,第3个阶段明显下降趋势。miR159的预测靶基因为Gb02586（功能注释为MYB基因）在种胚3个休眠阶段的表达水平呈上升趋势,与miR159的表达模式基本相反。此外,还利用Cytoscape软件技术平台构建差异表达的关键miRNAs及其靶基因的互作调控网络。结果发现,同一个miRNA存在多个靶基因,同时有些miRNAs还有唯一靶向的靶基因,也存在共同的靶基因。（8）我们分别对 6 个已知 miRNA（miR156a、miR156b、miR159a、miR166c、miR164a、miR172a）和2个新的miRNA（novelmiR89、novelmiR141）的前体序列及部分靶基因进行荧光定量实验,进一步验证银杏种胚中miRNA及靶基因在种胚发育3个时期的表达模式,验证结果与sRNA-Seq表达趋势基本保持一致,说明我们测序结果可信。综上所述,本研究对银杏种子休眠过程中的种胚的形态变化、生理指标测定、不同层积方式解除种子休眠以及小RNA组学进行全面地分析,为研究银杏种子休眠过程与休眠解除提供一定的理论参考。