研究背景胶质母细胞瘤(GBM)是世界卫生组织根据临床病理特征定义为ⅣV级恶性星形细胞瘤,它可以来源于原发性的GBM,也可以由低级别的胶质瘤(Ⅱ和Ⅲ级)演变而来,是一种高度侵袭性的脑肿瘤;尽管目前在手术切除、放射治疗和化疗方面有明显改进,但患者的生存中位数仍不到6个月。目前对GBM的侵袭转移机制尚不明确,因此探讨GBM侵袭与转移的分子机制对GBM的治疗有重要的意义。黑色素瘤抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)最早从黑素瘤细胞中筛选出来,MAGE不但在黑素瘤表达,在其他许多肿瘤中均能也表达,后来发现这是一个大家族,由多个亚家族构成。由于黑素瘤和胶质瘤都起源于神经外胚层,因此胶质瘤可能也享有与黑素瘤共同表达的抗原,目前越来越多的研究发现胶质瘤中亦表达MAGE。MAGE-D4是MAGE家族的新成员,是近年来新发现的肿瘤特异性抗原,在肿瘤的发生发展,尤其是侵袭转移方面发挥重要作用。本课题组前期研究发现,MAGE-D4mRNA和蛋白在胶质瘤中高表达,在多种正常组织中呈限制性表达。最近,一些研究表明MAGE-D4可促进口腔鳞状细胞癌和乳腺癌的生长及侵袭转移,但其对胶质母细胞瘤侵袭转移的影响及相关机制仍然未知。因此,探讨MAGE-D4在胶质母细胞瘤的侵袭转移中的作用,将有助我们了解胶质母细胞瘤发生发展的分子机制,评估MAGE-D4作为胶质瘤标志物和生物治疗的靶基因。第一部分 稳定感染细胞株的建立目的:构建MAGE-D4沉默和MAGE-D4过表达的慢病毒载体,感染胶质母细胞瘤细胞,建立MAGE-D4稳定沉默和MAGE-D4稳定过表达的胶质瘤细胞株。方法:1.MAGE-D4沉默实验:(1)设计和合成MAGE-D4 shRNA,构建MAGE-D4 shRNA慢病毒载体(pGLV3-shRNA-MAGED4)。(2)选择高表达MAGE-D4的胶质母细胞瘤细胞株(U87-MG,U251-MG),经过抗性筛选,建立稳定沉默MAGE-D4的细胞株,通过qRT-PCR和Western blot确定pGLV3-shRNA-MAGED4的干扰效率。根据干扰效率筛选干扰效率高的目的序列pGLV3-shRNA-MAGED4。2.MAGE-D4过表达实验:(1)RT-PCR扩增MAGE-D4基因开放阅读框架;(2)构建 MAGE-D4 慢病毒载体(LV5-MAGED4);(3)将LV5-MAGED4分别导入低表达MAGE-D4胶质母细胞瘤细胞株(SHG44和A172),经过抗性筛选后,建立稳定过表达MAGE-D4的细胞株;通过qRT-PCR和Western blot确定MAGE-D4的表达。结果:通过 pGLV3-shRNA-MAGED4 对 U87-MG 和 U251-MG 进行MAGE-D4的下调,qRT-PCR检测结果显示,U87-MG干扰效率为93.57%,U251-MG干扰效率为90.46%;Western blot检测结果显示,MAGE-D4蛋白表达水平明显下调,U87-MG为69.77%,U251-MG为70.11%。将LV5-MAGED4分别导入低表达MAGE-D4细胞株SHG44和A172,qRT-PCR结果显示,SHG44和A172的MAGE-D4 mRNA上调,分别为7.21倍和5.24倍;Western blot检测结果显示,MAGE-D4蛋白表达水平明显上调,SHG44 为 10.00 倍,U251-MG 为 5.46 倍。以U87-MG,U251-MG和SHG44,A172为亲本株,成功构建稳定沉默和过表达MAGE-D4蛋白的胶质母细胞瘤细胞株Si-MAGE-D4和OE-MAGE-D4。结论:建立MAGE-D4稳定沉默的胶质瘤细胞株(U87-MG和U251-MG),以及MAGE-D4稳定过表达的胶质瘤细胞株(SHG44和A172)。第二部分MAGE-D4对胶质母细胞瘤恶性生物学行为影响的体外实验目的:观察MAGE-D4对胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响;探讨MAGE-D4在胶质母细胞瘤细胞中的作用机制;初步了解MAGE-D4在肿瘤发生发展中的作用,为评价其用于肿瘤的辅助诊断和靶向治疗的可能性提供依据。方法:用稳定沉默和过表达MAGE-D4的胶质母细胞瘤细胞株进行以下实验:(1)CCK8法检测细胞增殖情况;(2)平板克隆形成试验检测细胞增殖集落形成情况;(3)流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况;(4)划痕实验检测细胞迁移能力及Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;(5)Westernblot检测细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白以及和P53通路相关蛋白表达。结果:MAGE-D4表达下调实验结果:(1)CCK8实验显示MAGE-D4稳定沉默的U251-MG和U87-MG细胞与对照组比较,其增殖能力下降(p<0.001);(2)克隆平板形成试验显示MAGE-D4稳定沉默的U251-MG和U87-MG细胞与对照组比较,其增殖集落形成能力下降(p<0.001);(3)流式细胞仪周期结果显示:MAGE-D4稳定沉默胶质母细胞瘤细胞株U251-MG阻滞在S/G2M期,而U87-MG无明显阻滞;Westernblot 检测 U251-MG 的 CyclinE 和 CDK2 蛋白表达明显升高,CyclinA和p21均无明显变化。凋亡检测显示MAGE-D4稳定沉默胶质母细胞瘤细胞株U251-MG凋亡率增加(早凋为主)(p<0.001),Westernblot 检测 Casepase-3蛋白表达增加,Casepase-9无变化,p53增加;U87-MG凋亡未见明显变化。(4)MAGE-D4稳定沉默的细胞与对照组比较,其迁移和侵袭能力下降,Westernblot 检测 MMP-2,MMP-9 下降。MAGE-D4表达上调实验结果:(5)CCK8实验显示MAGE-D4稳定过表达的SHG44和A172细胞与对照组比较,其增殖能力升高(p<0.001);(6)克隆平板形成试验显示MAGE-D4稳定过表达的SHG44和A172细胞与对照组比较,其增殖集落形成能力升高(p<0.001);(7)流式细胞仪周期结果显示:MAGE-D4稳定过表达胶质母细胞瘤细胞株SHG44和A172无明显阻滞;Westernblot检测两株细胞的p21均无明显变化;凋亡检测显示MAGE-D4稳定过表达的胶质母细胞瘤细胞株SHG44和A172两株细胞的凋亡未见明显变化,Westenrblot 检测 Casepase-3,Casepase-9和p53均未见明显变化。;(8)MAGE-D4稳定过表达的细胞与对照组比较,其迁移和侵袭能力升高,Westernblot检测MMP-2,MMP-9无明显变化。结论:下调MAGE-D4可抑制U251-MG和U87-MG增殖;U251-MG呈现细胞周期阻滞于S和G2/M期并伴有凋亡增加,而对U87-MG细胞周期和凋亡无明显影响;下调MAGE-D4导致U251-MG和U87-MG的迁移和侵袭能力下降。上调MAGE-D4促进SHG44和A172增殖;但细胞周期和凋亡无明显影响;上调MAGE-D4能促进SHG44和A172的迁移和侵袭能力。第三部分 下调MAGE-D4对裸鼠胶质瘤移植瘤生长的影响目的:体内实验验证MAGE-D4对胶质母细胞瘤裸鼠移植瘤生长的影响;方法:1.用胶质母细胞瘤U251-MG在BALB/CA雌性裸鼠皮下种植,建立裸鼠移植瘤模型,分别皮下植入无关序列组和MAGE-D4目的序列组,每组6只裸鼠;2.四周后处死裸鼠,测皮下肿瘤体积,通过免疫组织化学检测MAGE-D4在肿瘤中的表达以验证体内实验的结果。结果:在胶质母细胞瘤裸鼠皮下移植瘤模型中,与对照组相比较,MAGE-D4稳定沉默U251-MG细胞株皮下移植瘤明显减小。结论:下调MAGE-D4可抑制裸鼠皮下移植瘤的形成。