猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine,MPS)是一种由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的猪慢性呼吸道疾病,几乎遍布世界各养猪国家。该病发病率高、死亡率低,但一旦发生很难根除。Mhp损伤猪的呼吸道纤毛和上皮细胞,增加其它呼吸道病原继发感染的机会,加大了疾病诊治的难度,严重威胁全球养猪业。研究Mhp的致病机制可为药物靶标设计和疫苗研发提供依据,对MPS的防控大有裨益。由于Mhp的体外固体培养非常困难而且遗传操作系统不成熟,对其致病机制的了解还不够深入。筛选新的毒力相关因子,分析造成不同菌株间毒力差异的影响因素,对阐明Mhp的致病机理,有效防控该病具有十分重要的意义。本研究以猪肺炎支原体强毒菌株Mhp 168株及其传代致弱的疫苗株Mhp 168L株的全菌蛋白为研究对象,利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)技术结合LC-MS/MS差异蛋白质组学方法,全面鉴定两者之间的差异表达蛋白,并选择在强毒菌株高表达的潜在相关毒力因子——脂蛋白mhp390进行深入研究。主要研究内容和结果如下:1.猪肺炎支原体强弱毒菌株的比较蛋白质组学研究首先测定Mhp 168株与Mhp 168L株的生长曲线,确定了最佳收样时间。将提取的全菌蛋白通过i TRAQ技术结合LC-MS/MS进行比较蛋白质组学分析,共鉴定到489个蛋白,约占基因组编码蛋白的70%,包括125个功能未知蛋白。鉴定到的差异表达蛋白共70个,35个在Mhp 168株中高表达,35个低表达。将差异表达蛋白进行GO功能显著性富集分析,“分子功能”中富集最显著的前三类依次是“催化活性”、“甲基转移酶活性”和“激酶活性”;“生物过程”富集最显著的是“小分子分解代谢过程”,其次是“肌醇分解代谢过程”、“有机羟基化合物分解代谢过程”、“细胞碳水化合物分解代谢过程”、“乙醇分解代谢过程”和“多元醇分解代谢过程”。对差异表达蛋白的Pathway显著性富集分析显示,差异表达蛋白主要参与“不同环境中的微生物代谢”和“磷酸肌醇代谢”两条生物途径。参与磷酸肌醇代谢途径的蛋白在弱毒疫苗株中全部上调表达,Mhp可能保留其在宿主体内降解肌醇的能力,并且这种能力随着体外传代次数的增加而增强。此外,参与核苷酸合成与分解代谢的蛋白Ula A、MHP168＿564、Prs A、Deo D、Tdk、Hpt和Pyr G在强毒菌株Mhp 168株中均显著上调表达。这些蛋白的高表达可能使强毒菌株中磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)以及核苷酸的合成增加,增强菌株对活性氧(reactive oxygen species,ROS)损伤的防御能力。通过Virulent Pred预测和查找文献对在强毒菌株中高表达的蛋白进行“毒力蛋白”预测,共鉴定出25个潜在毒力因子。差异表达蛋白中在强毒菌株高表达的8个功能未知蛋白全部为“毒力蛋白”,在其它病原菌中证实与毒力相关的“兼职”型胞内酶(延伸因子Tu、烯醇酶和内切-1,4-β-葡聚糖酶等)、转运蛋白(Mgt E和Pac L等)、脂肪酸蛋白连接酶(Lpl A-1和Lpl A)和转录调控因子Rnc等很可能是Mhp的毒力相关因子。脂蛋白mhp390(Mhp168＿418,P68)在Mhp 168株中显著上调表达且被预测为“毒力蛋白”。鉴于脂蛋白在支原体的致病中发挥十分重要的作用,而猪肺炎支原体的mhp390功能尚不清楚,因此选择mhp390进行深入研究。2.差异表达蛋白mhp390的功能研究对Mhp 168株的mhp390蛋白进行生物信息学分析,预测结果显示mhp390是一个具有典型脂蛋白信号肽结构的膜蛋白。在大肠杆菌中高效表达mhp390重组蛋白并制备抗血清。用抗mhp390的抗血清对Mhp的全菌蛋白、分离的膜蛋白组分和胞浆蛋白组分进行检测,在全菌蛋白和膜蛋白组分中均可以检测到mhp390,但在分离的胞浆蛋白中检测不到,证实mhp390是一种膜脂蛋白。用重组表达的mhp390蛋白与提取的猪气管纤毛蛋白进行黏附实验,发现mhp390可以与纤毛蛋白特异性结合,且具有一定的剂量依赖性,提示mhp390是一种新发现的纤毛黏附蛋白,可能在猪肺炎支原体吸附猪气管纤毛上皮细胞中发挥重要作用。用mhp390蛋白处理猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),发现淋巴细胞和单核细胞的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例都显著增加,证实mhp390具有诱导PBMCs细胞凋亡的能力,而且mhp390抗血清可以完全抑制mhp390的促凋亡作用。此外,用mhp390蛋白处理猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs),发现mhp390可以激活caspase-3,诱导PAMs凋亡,同时也可以诱导促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达和释放,但抗mhp390的抗血清不能抑制mhp390和猪肺炎支原体诱导的炎症反应。上述结果在一定程度上分析了猪肺炎支原体强弱毒菌株毒力及生理差异的分子机制,筛选出了25个潜在毒力相关因子,揭示了脂蛋白mhp390在猪肺炎支原体感染过程中的功能,表明mhp390是猪肺炎支原体的一个新的毒力相关因子,为深入理解猪肺炎支原体的致病机理提供了科学依据。