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舌鳞状细胞癌(TSCC)是口腔癌中最常见的类型,其特点是高转移和侵袭性生长的能力。以往研究表明,在不同的癌症类型中,包括TSCC,肿瘤相关microRNA的异常表达可能与肿瘤的发生、发展有关。MiRNAs通过RNA诱导的沉默复合体的作用,将miRNA分子与靶mRNA的3’非翻译区(UTR)结合来抑制靶基因的表达;这导致靶mRNA降解或抑制mRNA翻译。研究表明,原癌基因的激活和肿瘤抑癌基因的失活可能与舌鳞癌发病密切关联。然而,TSCC潜在的发生和发展相关的详细的分子学机制尚未阐明。因此,必须更深入了解调控舌鳞状细胞癌发病的相关机制,以期更有效防止疾病的发生及复发,最终提高患者的生存率。miR-509因其在人类许多常见肿瘤中的肿瘤抑制作用,已被确定为在肿瘤发生和发展中的一个关键调节因子。在本研究中,我们通过实时荧光定量PCR检测TSCC肿瘤组织和细胞系中miR-509的表达。通过MTT和侵袭实验分别评估miR-509对舌鳞癌细胞增殖和侵袭的影响。另外,我们通过实时荧光定量PCR、westernblot和双荧光素酶报告基因实验等一系列实验鉴定在TSCC组织中miR-509的直接靶基因。本研究发现,miR-509在舌鳞癌组织标本和细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调,在体外过表达miR-509则抑制舌鳞癌细胞增殖,侵袭和转移。通过网络计算机预测软件预测在舌鳞癌组织中miR-509靶基因为表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)。下调EGFR表达能抑制TSCC肿瘤细胞的增殖和侵袭,其作用类似于过表达miR-509所引起的TSCC肿瘤细胞生物学变化。另外,在Tca8113和Cal-27中,过表达miR-509下调EGFRmRNA和蛋白的表达,且下调EGFR下游信号分子P-AKT和P-ERK1/2表达。EGFRmRNA在TSCC组织中高表达,miR-509在TSCC组织中低表达,Spearman相关分析显示在舌鳞癌组织中miR-509的表达与EGFR的表达呈负相关。总之,miR-509通过直接靶向EGFR可抑制舌鳞癌细胞增殖和侵袭,从而表明,miR-509/EGFR轴可能具有作为一种新的治疗舌鳞癌病人的靶向治疗方法的潜能。第一部分miRNA-509抑制TSCC增殖、迁移及侵袭的体外实验研究[目的]miR-509因其在人类许多常见肿瘤中的肿瘤抑制作用,已被确定为在肿瘤发生和发展的一个关键调节因子。本部分实验来检测miR-509异常表达所引起的舌鳞癌细胞的生物学变化。[方法]1)通过荧光定量PCR检测miR-509在TSCC肿瘤组织及细胞系中的表达。2)MTT法检测过表达miR-509对TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)增殖的影响。3)Transwell小室迁移和侵袭实验分析过表达miR-509对TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)迁移和侵袭的影响。[结果]1)miR-509 在 28 个配对的 TSCC 组织及 TSCC 细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调。2)在TSCC细胞系(Tca8113,Cal-27)中,过表达miR-509能抑制细胞增殖。在转染2天和3天后细胞增殖出现显著下降,差异均有统计学意义。3)Transwell小室迁移和侵袭实验显示,过表达miR-509显著抑制了 Tca8113,Cal-27细胞的迁移和侵袭。[结论]miR-509 在 TSCC 肿瘤组织及 TSCC 细胞系(Tca8113,SCC-15,CAL-27)中表达下调。过表达miR-509抑制Tca8113,CAL-27的细胞增殖、迁移和侵袭,在TSCC中发挥抑癌基因作用。第二部分鉴定直接靶向miR-509的靶基因[目的]通过靶基因预测软件找寻TSCC中直接靶向miR-509的靶基因,在TSCC组织及细胞系中验证所选的靶基因EGFR其mRNA及蛋白表达是否受miR-509调节,并对相关机制做进一步分析。[方法]1)应用靶基因预测软件 microma.org(http://www.microrna.org)和 TargetScan(www.targetscan.org)筛选可能直接靶向miR-509的靶基因,根据mirSVR值进一步筛选。2)通过Westernblot检测在TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)中转染miR-509模拟剂后EGFR蛋白及EGFR下游信号通路的关键分子(AKT、P-AKT、ERKI/2、P-ERKI/2)的表达情况,并通过qRT-PCR检测转染miR-509模拟剂后EGFR mRNA的表达情况。3)通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-509是否直接靶向EGFR mRNA的3’UTR端。4)RNA干扰分析沉默EGFR后是否能模拟miR-509过表达所引起的TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)的细胞增殖、迁移及侵袭能力下降改变。5)qRT-PCR检测EGFR在28对TSCC组织及正常组织中mRNA表达,通过Spearman相关分析评估在TSCC组织中EGFR mRNA表达与miR-509表达的相关性。[结果]1)通过靶基因预测软件 microma.org(http://www.microma.org)和 TargetScan(www.targetscan.org),预测 miR-509 的靶基因为 EGFR。2)Westernblot实验显示转染miRNAs模拟剂和阴性对照(miR-509mimics、miR-NC)72 小时后,转染 miR-509mimics 组显著抑制 Tca8113 和CAL-27细胞中EGFR蛋白表达。过表达miR-509显著抑制EGFR下游的信号分子。在Tca8113和Cal-27中,过表达miR-509显著下调P-AKT和P-ERK1/2表达,但对AKT和ERK1/2表达无影响。qRT-PCR证实,转染miR-509mimics组下调Tca8113和CAL-27细胞中EGFR mRNA表达。3)双荧光素酶报告基因实验证实miR-509直接作用于EGFRmRNA的3’UTR端,从而抑制EGFR的表达。4)RNA干扰沉默EGFR后,Tca8113,CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制,与过表达miR-509所引起的肿瘤细胞的生物学变化结果相似。5)EGFRmRNA在28对TSCC组织中高表达,Spearman相关分析显示EGFR mRNA和miR-509在TSCC组织中表达呈负相关。[结论]1)过表达miR-509能下调TSCC细胞系(Tca8113,CAL-27)中EGFR的表达,且对EGFR下游信号通路有不同程度的抑制作用。2)EGFR mRNA的3’UTR端是miR-509的直接作用靶点3)miR-509通过负调控EGFR的表达而参与TSCC肿瘤的发生和发展。