纳豆激酶(nattokinase，subtilisin NAT，NK)是纳豆发酵生产过程中由纳豆枯草芽孢杆菌分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，属枯草杆菌蛋白酶家族，具有强烈的溶栓活性，可望开发成为一种新型的口服溶栓药物。纳豆激酶的结构与功能是纳豆激酶研究与开发过程中重要的基础研究课题，对其的深入研究将有助于加深人们对纳豆激酶溶栓机理的认识和理解，推动纳豆激酶基因工程及蛋白质工程改造的研究。　　 本研究的第一部分内容是纳豆激酶S3底物结合位点结构与功能的研究。首先从纳豆芽孢杆菌中克隆了NK基因，并成功使其在Bacillus subtilis DB104中表达。然后作者通过同源建模获得NK的三维结构，结构分析比较结果表明NK的S3位点位于酶分子的表面，由Gly100、Ser101和Leu126三个氨基酸残基组成。为探索S3位点对酶的蛋白酶活性及底物特异性的影响，将其组成残基分别突变为不同性质的氨基酸残基。以人工合成的三种四肽作为底物(仅P3残基不同)，测定突变酶的动力学参数，并用纤维平板法测定了获得的20种突变酶的纤溶活性。结果显示在Gly100处引入大体积或带正电的残基侧链会降低酶的底物结合能力，并大大降低其催化效率，但这些残基引入Ser101处却可明显提高NK的蛋白酶及(或)纤溶酶活性，Gly100和Ser101显示了相反的空间和电荷效应。在Leu126处引入的突变可能破坏了酶催化中心的结构，因而导致酶活大幅度下降。突变酶的动力学研究结果表明NK的S3位点对保持酶的活性具有十分重要的作用，但对酶底物特异性的影响较小。本研究增进了人们对NK及其它枯草杆菌蛋白酶的P3-S3相互作用关系的了解，同时提供了通过蛋白质工程手段提高NK溶栓活性的实例。　　 本研究的第二部分内容是纳豆激酶基因启动子的改造。为探索通过启动子改造以提高重组NK表达量的可能性，分别将NK基因启动子Papr的-10区序列由原来的TACAAT突变为σA-依赖型启动子的保守序列TATAAT，将其-35区序列由原来的TACTAA突变为σA-依赖型启动子的部分保守序列TACACA。另外，将NK基因置于两个串联启动子控制下进行表达。使用纤维平板法测定各重组菌株中NK的表达量，同时用northern杂交方法检测NK基因转录水平。纤溶酶活性分析结果表明，Papr的-10区突变可使分泌型NK表达量从272μg/mL提高到643μg/mL(提高136％)，该突变还可使胞内表达的β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)表达量提高249％。Northern杂交结果显示-10区突变可明显提高NK基因的转录水平。将PaprN的-35区中两个碱基突变为保守序列后，NK表达量比对照提高13％。两个启动子串联未能更大幅度地提高NK或GUS的表达量。以上有关启动子的研究结果表明改造NK基因的-10区或-35区可显著提高NK在B.subtilis中的表达量，这可能是通过基因工程方法提高NK产量的一条有效途径。