肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)是全球位于第6位,中国位于第3位的常见恶性肿瘤。根据国际癌症研究中心估计,2000年全球肝癌发病数为56.4万人,其中约55%发生在中国,因肝癌死亡约30.0万人,而且有上升的趋势。由于肝癌的恶性程度高,发展迅速,治疗困难,总体疗效仍不理想,手术切除仍是治疗肝癌的首选方法,但其疗效远不令人满意,主要原因是肝癌术后复发。随着肝胆外科的发展,肝移植已经成为治疗肝癌的选择手段之一。肝移植术通过切除整个病肝,消除了肝内转移灶和潜在生癌的“土壤”,但是即使严格适应症后的肝移植治疗肝癌,术后仍有患者出现移植肝内肿瘤复发。为什么肝癌患者肝移植后仍然会复发?是来源于游离于外周血中肝癌细胞,还是另有原因?因此,深入研究肝癌手术切除及肝移植术后的复发机制,探索防止转移、复发的新策略和新方法成为肝癌基础研究中亟待解决的课题。近年来有关干细胞的研究加深了对肿瘤发生、发展的认识,提出了“肿瘤来源于干细胞”、“肿瘤中存在肿瘤干细胞”等学说,为肿瘤复发机制研究找到了一个崭新的突破点。干细胞与肝癌的发生同样有密切关系。Shchaf等发现肝癌中存在一小群处于静止期的癌细胞,能够导致肿瘤的复发。在Myc原癌基因能够可控性表达的转基因小鼠上,当Myc基因表达时,转基因小鼠形成肝癌;当Myc基因关闭后,转基因小鼠的肝癌消退。若将肿瘤细胞制成悬液注射至SCID小鼠皮下,同样能够形成肿瘤,并且为Myc基因表达依赖性。肿瘤消退时肝癌细胞有三种归宿:1、大部分凋亡;2、分化为肝细胞和胆管上皮细胞;3、处于静止期,表达肝干细胞标志物(CK-19)、不表达肿瘤细胞标志物。这群处于静止期的细胞在Myc基因重新开放时能够再次形成与原肿瘤类似的肿瘤,并且能够在体内连续传代。这提示肝癌内也存在具有干细胞特性的肿瘤细胞。最近有报道,已经在肝癌细胞系中分离出肝癌干细胞。Chiba等利用流式分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)在三种肝癌细胞系中分选出一小群SP (Side Population)细胞,此群细胞仅占0.25%- 0.80%,具有肿瘤干细胞特征,仅103个就能够在NOD/SCID小鼠体内形成肝癌,并且可体内连续传代。Yin等在肝癌SMMC-7721细胞系中分选出一小群CD133~+细胞,此群细胞具有高致瘤性,具有一定的肿瘤干细胞特性。慢性肝损伤及损伤后修复与肝癌的发生有密切关系。有研究表明,骨髓干细胞参与慢性肝损伤的修复。肝脏轻度受损时,成熟肝细胞或胆管细胞经过1～2次有丝分裂,就可以恢复肝脏体积与功能;Peterson等首先发现大鼠骨髓干细胞参与了肝脏损伤的修复,他们将性别交叉骨髓移植后大鼠进行2/3肝切除同时用2-AAF阻止正常肝细胞增殖,此时卵圆细胞大量增殖,原位杂交检测发现,部分卵圆细胞表达雄性骨髓供体标记,说明骨髓干细胞分化为卵圆细胞从而参与肝损伤修复。Theise等在小鼠模型中也证实此种现象。近来关于骨髓干细胞参与肝损伤修复报道逐渐增多,研究也逐渐深入。但是,目前对于骨髓干细胞是否参与了肝癌的发生研究的比较少。基于上述研究,我们推测骨髓干细胞很可能参与了肝癌的发生过程,并且在其中扮演了至关重要的角色。从这个角度出发,可以更好地解释肝癌切除术后的复发,特别是肝移植术后复发的原因。我们认为,肝癌应该是一种全身性疾病,虽然表现为肝脏生长肿瘤,但实际上具有肝细胞分化潜能的骨髓干细胞发生突变也是导致肝癌发生的原因之一。肝移植虽然彻底的移除了病灶,更换了新的肝脏(土壤),但是病变的骨髓干细胞(种子)依然能够在新肝脏(土壤)中形成肿瘤,从而导致复发。本课题旨在通过性别交叉骨髓移植、肝移植大鼠诱癌模型证明骨髓干细胞参与了肝癌的发生,并在此理论基础上探讨肝前体细胞(胚肝细胞)对大鼠肝癌的影响。第一部分:通过骨髓移植建立雌雄嵌合体大鼠模型并DEN诱发肝癌本部分主要是通过性别交叉骨髓移植建立稳定的雌雄嵌合体大鼠模型(雌性大鼠移植了雄性骨髓干细胞),并利用PCR检测Sry基因(性别决定基因,Y染色体标记)鉴定模型是否构建成功;然后将雌雄嵌合体大鼠饲喂DEN(二乙基亚硝胺)诱发肝癌。结果:通过性别交叉骨髓移植,成功建立了雌雄嵌合体大鼠模型,并通过PCR进行了证实,使追踪骨髓干细胞成为可能;同时,经过尽心的饲养与护理,获得10例珍贵的雌雄嵌合体大鼠肝癌标本,为下一步的实验打下了坚实基础。第二部分:通过性别交叉肝移植建立雌雄嵌合体大鼠模型并DEN诱发肝癌本部分主要是通过性别交叉肝移植建立稳定的雌雄嵌合体大鼠模型(雄性大鼠移植了雌性肝脏),然后将雌雄嵌合体大鼠饲喂DEN(二乙基亚硝胺)诱发肝癌。结果:通过性别交叉肝移植,成功建立了雌雄嵌合体大鼠模型,经过精心的饲养与护理,获得4例珍贵的雌雄嵌合体大鼠肝癌标本,为下一步的实验打下了坚实基础。第三部分:探讨骨髓干细胞是否参与大鼠肝癌的发生。本部分旨在探寻骨髓干细胞是否参与肝癌的发生。14只雌雄嵌合体大鼠肝癌标本(10只骨髓移植后,4只肝移植后),我们首先通过H-E染色及免疫组织化学明确诊断为肝细胞癌;然后在分子水平证实肝癌组织含有雄性细胞——PCR检测肝癌组织Sry基因(Y染色体特异性标志)阳性,同时在形态学上证实肝癌组织含有雄性细胞——荧光原位杂交(FISH)检测肝癌组织中存在Y染色体阳性细胞。通过对连续切片的病理结构及FISH结果比较分析,确定雌雄嵌合体肝癌组织存在Y染色体阳性肝癌细胞。以上这些结果表明:骨髓干细胞参与了肝癌的发生。第四部分:探讨胚肝细胞对大鼠原发性肝癌影响本部分旨在探讨肝前体细胞(胚胎肝细胞)对于大鼠肝癌的影响。从目前的实验结果来看,骨髓干细胞参与了大鼠肝癌的发生;同时,骨髓干细胞是一种多能干细胞,分化成血液细胞、肝脏细胞、肌肉细胞、神经细胞等。我们推测:骨髓干细胞迁移至肝脏后,首先分化为肝前体细胞,然后再分化为肝细胞和胆管上皮细胞,参与慢性肝损伤修复和肝癌发生。14天胚胎大鼠的肝脏内含有大量肝前体细胞(胚肝细胞),这些肝前体细胞对肝癌有什么影响呢?5只SD诱癌90天大鼠经尾静脉多次补充胚肝细胞,观察大鼠的生存期及肿瘤生长情况;对照组为同批次5只诱癌大鼠。结果:与对照组相比,处理组大鼠身体状况差,生存期缩短,肝癌肿块明显增大,肝内浸润、转移增多,均有门静脉癌栓。以上这些结果提示胚肝细胞对中晚期肝癌有促进作用。结论1、通过性别交叉骨髓、肝移植构建了雌雄嵌合体大鼠,为追踪骨髓干细胞提供了良好动物模型;2、雌雄嵌合体大鼠成功诱发肝癌,并追踪发现骨髓干细胞参与大鼠肝癌的发生;3、发现胚肝细胞(肝前体细胞)对大鼠中晚期肝癌有促进作用