基于TCGA数据库筛选乳腺癌预后相关的肿瘤微环境免疫调节因子

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目的:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,也是女性因癌症死亡的主要原因。尽管我国女性乳腺癌发病率和死亡率略低于欧美国家,但由于人口基数大、筛查率低,导致乳腺癌的总发病例数和死亡病例远超其他国家。随着国民经济的提升以及我国医疗卫生事业的发展,乳腺癌的早期诊断和干预治疗极大地提高了早期患者的生存率,并与欧美国家基本持平。然而晚期乳腺癌患者的预后依然很差,五年生存率约20%,这对女性的健康造成极大威胁。随着近五十年来针对肿瘤微环境的研究兴起,逐渐揭示了肿瘤微环境在肿瘤发生、发展中的重要作用。肿瘤细胞和微环境之间相互交流改变了肿瘤微环境生态,也影响了疾病的进展和临床结果。其中,肿瘤浸润的免疫细胞更是在肿瘤进展中发挥了双重作用。乳腺癌最初被认为是一种非免疫原性肿瘤,但随着研究的深入揭示了乳腺癌肿瘤微环境中丰富的免疫环境。越来越多的证据表明,免疫浸润水平对肿瘤的进展及患者的预后意义重大,特别是部分预后极差的肿瘤类型,例如三阴乳腺癌。因此,全面的评估肿瘤微环境对乳腺癌预后的影响以及筛选对肿瘤进展具有重要意义的免疫调节因子对临床研究及乳腺癌免疫治疗具有重要的参考意义。方法:本研究基于TCGA数据库下载了关于浸润性乳腺癌的转录组数据及其临床信息文件,从中提取基因表达数据与临床信息合并成为基因表达矩阵。首先,我们应用R软件中的“estimate”包,以ESTIMATE算法来估计每个乳腺癌样本的TME中的免疫、基质成分的比例,并以Immune Score,Stromal Score和ESTIMATE Score这三种分数的形式展现出来。将三种量化分数与乳腺癌病例的生存信息合并,通过R软件中“sursvive”和“survminer”包以log-rank p<0.05作为显著性标准进行Kaplan–Meier生存分析,并分析分数与临床病理参数的相关性。随后,我们使用R软件中的“limma”包以差异倍数大于1且FDR法校正后的p值小于0.05(︱log2FC︱>1&FDR<0.05)为纳入标准,并采用Wilcoxon秩和检验分别筛选基质、免疫高分组样品与低分组样品中的DEGs。两组DEGs取交集后获得了TME中共享的DEGs,并对其进行了GO和KEGG富集。单因素COX回归筛选了DEGs中的预后基因。通过STRING在线数据库使用DEGs构建了置信度大于0.7的蛋白互作网络图,并应用Cytoscape软件重构了蛋白互作节点基因。单因素COX回归分析和蛋白互作节点基因相交分析获得本研究最有价值的关键基因。通过R软件分析关键基因在肿瘤样品与正常样品的表达差异以及生存分析、临床病理特征相关性分析。基因集富集(GSEA)分析预测关键基因可能涉及的生物功能和分子途径。最后,应用R软件以CIBERSORT算法估算所有肿瘤样品中的肿瘤浸润免疫细胞亚群的比例分布情况,并分析其与关键基因表达之间是否相关。结果:(1)肿瘤微环境评分与浸润性乳腺癌患者生存分析及病理特征相关性分析显示:乳腺癌中的免疫成分与患者年龄P=0.045、生存率(p=0.009)显著相关,但与临床分期无关;基质成分与患者年龄(p=0.033)、T分期(p=0.002)、TNM分期(p=0.015)显著相关,与患者生存率无关。(2)本研究共筛选得到基质和免疫成分中共同的224个DEGs,其中有203个基因表达上调,21个基因表达下调。(3)GO富集显示DEGs涉及的生物功能有淋巴细胞的分化、T细胞的活化等;KEGG富集显示差异基因参与的分子途径有趋化因子信号传导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用和造血细胞谱系等。(4)单因素COX回归分析从DEGs中筛选得到30个预后显著基因;PPI网络图构建了116个蛋白节点;相交分析获得了包含CLEC10A在内的15个关键基因。(5)CLEC10A在肿瘤组织中较正常组织低表达,并与患者预后显著相关;临床相关性分析显示CLEC10A表达与患者年龄(p=2×10-6)、T分期(p=7×10-6)、TNM分期(p=0.022)显著相关。(6)基因集富集分析显示CLEC10A高表达涉及的分子途径有抗原处理和呈递、B细胞信号通路、补体信号通路、造血细胞谱系等免疫相关活动;CLEC10A低表达涉及糖基磷脂酰肌醇途径。(7)CLEC10A表达与记忆B细胞、幼稚B细胞、静止的树突状细胞、M1巨噬细胞、活化的记忆CD4+T细胞、静止的记忆CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞等8种免疫细胞数量呈正相关,与M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、中性粒细胞、静止的NK细胞等4种免疫细胞呈负相关。结论:我们基于TCGA数据库中乳腺癌的转录组数据分析证实了免疫浸润水平与乳腺癌患者预后显著相关,并且进一步研究发现关键基因CLEC10A可能是乳腺癌免疫微环境调节的重要因素。CLEC10A是免疫系统识别肿瘤相关抗原的特异性识别配体,特别是在抗肿瘤免疫起始阶段识别和呈递肿瘤抗原、启动免疫应答过程中发挥了重要的作用。因此,CLEC10A的表达水平可能有助于动态评估乳腺癌患者的治疗效果及预后,并为未来免疫治疗提供新的思路。
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