研究背景和目的鼻咽癌是我国南方地区及东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤,尤其以广东、广西、福建三省的发病率最高。目前普遍认为EB病毒感染、遗传易感性及饮食和环境中的某些化学促癌物、致癌物是鼻咽癌发病的三大因素,但具体的发病机制尚不清楚。由于鼻咽癌是一种分化程度低、转移能力强的恶性肿瘤,且其发病部位较为隐蔽,因此多数病人在确诊时已为中晚期且常伴有转移,五年生存率始终不超过70%。尽管随着诊断及治疗水平的提高,鼻咽癌的预后已有较大改善,但是仍有约30-40%的患者在4年内发生远处转移。因此探索鼻咽癌的发病机制、寻找到有价值的早期诊断标记物以及有效的治疗靶标具有重要的意义。肾素-血管紧张素系统(RAS)成分已成为癌症的重要标志物。该系统是一个内源性的血压、体液平衡和细胞生长的调控系统,其母体化合物血管紧张素原主要是在肝脏产生,由肾素降解而形成一个十肽的血管紧张素1(Ang I),然后Ang I分别被蛋白水解酶血管紧张素转化酶(ACE)和肽链内切酶催化生成两个生物学活性肽激素即八肽的血管紧张素2(Ang II)和七肽的血管紧张素-(1-7)[Ang(1-7)]o Ang(1-7)既可在循环系统也可在组织中产生,通过激活一个特异性的G蛋白偶联受体MasR来介导生物学效应,已经成为肿瘤治疗药物的研究热点。最近研究表明,Ang-(1-7)通过减少血管内皮生长因子(VEGF)及增加抗血管生成的sFlt-1而抑制前列腺癌移植瘤生长、肿瘤血管生成和癌细胞转移,因此该七肽可作为一种新的治疗前列腺癌抗血管生成及癌细胞转移药物。另有研究证实,Ang-(1-7)能够显著抑制人肺癌细胞及其移植瘤的生长和雌激素受体阳性的和HER2过表达的乳腺癌细胞及其原位瘤的生长。多个临床实验也证明了Ang-(1-7)对癌症患者的安全性和有效性。但是关于Ang-(1-7)与鼻咽癌的关系如何,迄今尚无相关报道。由于Ang-(1-7)在动物体内的半衰期较短(在人体内仅为0.42到0.61小时),用于治疗时需要每日注射或者采用皮下埋置微量渗透泵的方法给药,这显然限制了Ang-(1-7)的治疗作用,另外也提高了治疗费用。重组腺相关病毒(rAAV)以其低致病性、低免疫原性、能导致外源基因的长期稳定表达(可达10年以上)等特性而在基因治疗研究领域得到广泛应用；除欧美国家批准的第一个基因治疗药物Glybera外,已有多个临床实验证明了AAV的安全性和有效性,AAV8介导的肝靶向表达分泌性凝血因子IX对6个患严重血友病患者的治疗有效性至少两年；尤其最近几年利用定点突变技术或Shuffling技术获得突变型AAV载体,进一步提高了AAV的靶向性和有效性。因此,本课题旨在研究过表达Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞生物学特性的影响；然后在动物模型上研究优化的AAV载体介导的肝靶向表达分泌性Ang-(1-7)对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响,从而为将Ang-(1-7)作为靶基因进行鼻咽癌的基因治疗打下基础。研究内容和方法1.鼻咽癌中MasR的表达特性的鉴定采用荧光定量RT-PCR及Western blot方法从mRNA和蛋白水平检测MasR在鼻咽癌组织、鼻咽粘膜慢性炎组织及鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、HNE-1、5-8F和C666-1中的表达情况,并探讨MasR与鼻咽癌发生发展的关系。2.Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响将慢病毒载体质粒与辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装慢病毒,收集病毒上清并进行病毒滴度测定。将包装好的含Ang-(1-7)融合蛋白的慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE-1及CNE-2,荧光显微镜下观察慢病毒转导后增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的表达,Western blot检测病毒转导后Ang-(1-7)融合蛋白的表达情况；用细胞计数法、MTT法及平板克隆形成实验检测Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响；利用细胞体外划痕实验检测Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞体外迁移能力的影响；并且用MasR拮抗剂A-779验证MasR封闭后,Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞生物学行为影响的变化。3.Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响构建含Ang-(1-7)融合蛋白的腺相关病毒载体,包装纯化病毒[AAV8 (Y733F)核衣壳变异型]并测定病毒滴度。将悬于100 μl PBS中的1×106个鼻咽癌细胞CNE-1与100 μl Matrigel混匀后接种于6-8周雄性裸鼠右侧腋下建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。待瘤径达0.4 cm×0.3 cm左右时随机分成3组,每组6只,尾静脉注射0.1 ml AAV8(Y733F)-CBA-Ang-(1-7), AAV8 (Y733F)-CBA-eGFP或PBS,病毒量为5×1011 v.g/mouse。每3天对移植瘤大小进行测量直至1个月左右。观察结束时,处死动物,留取血样；取裸鼠肝脏做冰冻切片并在荧光显微镜下观察注射腺相关病毒AAV8 (Y733F)-CBA-eGFP组裸鼠肝脏中是否有绿色荧光蛋白的表达；用Western blot检测AAV8 (Y733F)-CBA-Ang-(1-7)组裸鼠肝脏中Ang-(1-7)融合蛋白的表达；用EIA法对裸鼠血清中Ang-(1-7)的表达进行定量；取肿瘤组织,经HE染色后在400高倍镜下对比观察,用免疫组化检测肿瘤组织中细胞增殖核相关抗原Ki67的表达。4.Ang-(1-7)作用机制研究利用荧光定量RT-PCR方法检测Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞CNE-1、 CNE-2及移植瘤中VEGF、PIGF、HIF-1α及VEGF受体(Flt-1、Flk-1和sFlt-1)在mRNA水平表达的影响；同时用免疫组化验证肿瘤组织中VEGF在蛋白水平的表达。Western blot检测过表达Ang-(1-7)对MAPK信号转导通路的影响,初步探索Ang-(1-7)抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移及移植瘤生长的机制。结果1.鼻咽癌中Ang-(1-7)受体MasR的表达1.1 MasR在鼻咽癌细胞中的表达采用荧光定量RT-PCR法检测MasR在鼻咽癌细胞株及鼻咽永生化上皮细胞NP69中的表达情况,结果表明MasR在鼻咽癌细胞株中的表达水平显著高于鼻咽永生化上皮细胞NP69(P<0.05)。结果显示MasR在成瘤且转移的CNE-2(A△Ct=-3.608+0.717)细胞中表达最高,在成瘤不转移的CNE-1(△ACt=-1.505±0.398)和HNE-1(△△Ct=-1.543±0.270)细胞中表达最低,而在C666-1(A△Ct=-2.851±0.274)和5-8F(△△Ct=-2.709±0.507)细胞的表达介于两者之间。单因素方差分析显示5种细胞株中MasR受体的表达具有显著性差异(F=27.608,P=0.000)。Western blot检测5种鼻咽癌细胞中MasR在蛋白水平的表达,结果与mRNA水平相一致。1.2 MasR在鼻咽癌组织中的表达采用荧光定量RT-PCR检测MasR在30例鼻咽癌及23例鼻咽粘膜慢性炎组织中的表达。在30例鼻咽癌组织中,有22例MasR呈阳性表达,阳性表达率为73.3%；在23例慢性鼻咽炎中,仅有7例表达MasR受体,阳性率为30.4%,两者表达水平的差异具有显著性(P=0.000)。进一步分析发现,MasR的表达与肿瘤侵犯的范围(P=0.007)、 淋巴结转移(P=0.020)、远处转移(P＝0.020)及临床分期(P=0.027)则显著相关。2.Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响2.1 Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞增殖的影响包装纯化慢病毒,并测得病毒滴度为108-109 v.g/ml。我们选用分化程度较低、转移性较强的CNE-2细胞及分化程度较高不转移的CNE-1细胞作为研究对象。慢病毒Lenti-Ang-(1-7)感染鼻咽癌细胞后,用Western blot及EIA法检测Ang-(1-7)的表达。然后采用细胞计数法、MTT法及平板克隆形成实验检测Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞增殖的影响,结果显示：① CNE1/Ang-(1-7)组细胞的增殖速率明显下降(F=35.180, P=0.000); MTT法同样显示CNE1/Ang-(1-7)组细胞的增殖速率下降(F=108.074,P=0.000)。说明Ang-(1-7)过表达可显著抑制鼻咽癌细胞增殖。平板克隆形成实验的结果显示CNE1/Ang-(1-7)细胞的克隆形成显著降低,具有显著性差异(F=158.383,P=0.000).②CNE2/Ang-(1-7)组细胞的增殖速率明显下降(F=56.857,P=0.000)；MTT法同样显示CNE2/Ang-(1-7)增殖速率下降(F=115.444,P=0.000)。平板克隆形成实验的结果显示CNE2/Ang-(1-7)细胞的克隆形成显著降低,与对照组相比具有显著性差异(F=184.413,P=0.000)。综上所述,Ang-(1-7)过表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖。2.2 Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞迁移的影响采用划痕实验验证Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌细胞体外迁移能力的影响,结果显示,与CNE1/eGFP和CNE-1细胞相比,CNE1/Ang-(1-7)细胞体外迁移速度显著下降,差异具有显著性(F=42.004,P=0.000)；与CNE2/eGFP和CNE2细胞相比,CNE2/Ang-(1-7)细胞体外迁移速度显著下降,差异具有显著性(F=33.731,P=-0.000),以上结果表明,Ang-(1-7)过表达抑制了鼻咽癌细胞的体外迁移能力。2.3 MasR是Ang-(1-7)发挥生物学效应的特异性受体采用BrdU掺入实验及Transwell迁移实验验证MasR被其拮抗剂A-779封闭前后Ang-(‘1-7)生物学功能的变化,结果显示,A-779可完全阻断Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞抑制增殖及迁移效应。3.Ang-(1-7)过表达对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响3.1鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长鼻咽癌CNE-1细胞接种裸鼠一周后,裸鼠皮下形成肉眼可见的肿瘤时随机分成3组,每组6只,尾静脉注射0.1 ml AAV8 (Y733F)-CBA-Ang-(1-7) AAV8 (Y733F)-CBA-eGFP或PBS,病毒量为5×1011 v.g/mouse。每3天对移植瘤的大小进行测量。观察结束,处死动物并剥离肿瘤,测量得瘤体大小分别为AAV8 (Y733F)-CBA-Ang-(1-7)组(206.520±39.689) mm3, AAV8(Y733F)-CBA-eGFP组为(407.240±33.073)mm3,PBS组为(397.084±39.692)mm3,说明Ang-(1-7)可抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长。3.2 Ang-(1-7)在裸鼠体内的表达用荧光显微镜分别观察AAV-Ang-(1-7), AAV-eGFP或PBS三组裸鼠肝脏组织的冰冻切片中绿色荧光蛋白的表达。可观察到AAV-eGFP组肝脏组织中有均匀的较强的绿色荧光表达,而AAV-Ang-(1-7)与PBS组中未见绿色荧光蛋白表达。由于此腺相关病毒靶向肝脏表达,因此用免疫组化及Western blot可检测到AV-Ang-(1-7)组肝脏组织中有较强的Ang-(1-7)融合蛋白表达,我们采用EIA可检测到AV-Ang-(1-7)组裸鼠血清中Ang-(1-7)的量为247.5 ng/ml,而对照组中Ang-(1-7)的表达约为20 ng/ml。3.3免疫组织化学法检测Ki67的表达裸鼠肿瘤组织切片采用Envision法进行免疫组化,结果在光镜下观察并拍照,细胞核染成棕黄色定为阳性,每张切片随机选10个高倍(×200)视野。免疫组化结果显示,Ki67蛋白的表达主要定位于细胞核,Ki67蛋白在对照组(eGFP组和PBS组)中表达更为明显,呈棕黄色颗粒差异具有统计学意义。4.探索Ang-(1-7)的作用机制4.1 Ang-(1-7)抑制鼻咽癌细胞增殖的机制荧光定量RT-PCR检测VEGF、PIGF、HIF-1α及VEGF受体在mRNA水平的表达,结果显示,与对照组细胞相比,CNE1/Ang-(1-7)细胞中VEGF、PIGF、 HIF-1α、Flk-1、Flt-1的mRNA表达分别下降43.7%、58.0%、53.0%、40.3%和55.3%,而sFlt-1的mRNA水平表达约升高3.4倍。CNE2/Ang-(1-7)细胞中细胞中VEGF、PIGF、HIF-1α、Flt-1及Flk-1水平表达平均分别下降53.7%、72.7%、57.6%、31.7%,39.3%、而sFlt-1的表达水平升高约3.7倍。Western blot检测Ang-(1-7)过表达对MAPK信号转导通路的影响,结果显示,与对照组细胞相比,过表达Ang-(1-7)可抑制细胞中p38及p44/42MAPK的磷酸化,以上结果表提示,Ang-(1-7)可能通过抑制p38及p44/42MAPK的激活而抑制细胞的增殖及迁移。4.2 Ang-(1-7)抑制移植瘤生长的机制采用荧光定量RT-PCR检测裸鼠移植瘤内VEGF、PIGF、HIF-1α及VEGF受体表达变化,结果显示,与对照组细胞相比,AAV-CBA-Ang-(1-7)组VEGF. PIGF、HIF-1α、Flk-1、Flt-1的表达在mRNA水平分别下调47.0%,56.4%,68.8%,42.2%和57.6%,而sFlt-1的mRNA水平表达约升高5倍。结论1. MasR在鼻咽癌细胞株及鼻咽癌组织中表达上调,并且与细胞的恶性程度,肿瘤的转移及演进相关。2.Ang-(1-7)可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖及迁移；MasR是Ang-(1-7)发挥生物学作用的特异性受体。3.体内实验表明,Ang-(1-7)可显著抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长。4.Ang-(1-7)可以抑制血管生成因子VEGF、PIGF、HIF-1α及升高sFlt-1的表达,并且抑制p44/42及p38MAPK信号通路的磷酸化,推测这个可能是Ang-(1-7)抑制鼻咽癌细胞增殖及迁移的机制。本研究的创新之处1.在mRNA和蛋白水平首次证实MasR在鼻咽癌细胞和组织中表达上调,并且与肿瘤转移及演进相关,这为进一步理解鼻咽癌的发病机制和寻找新的早期诊断分子及靶向治疗靶点提供新线索；2. 研究Ang-(1-7)对鼻咽癌的影响尚数首例,并且进一步发现,MasR是Ang-(1-7)发挥生物学效应的特异性受体；3.在探索Ang-(1-7)对鼻咽癌细胞生物学行为影响的机制方面,我们不仅证明Ang-(1-7)通过对鼻咽癌细胞血管生成因子的调控来发挥效应,而且首次阐明其与MAPK信号通路密切相关,与其是p38、p44/42MAPK通路；4.采用可以靶向肝脏表达的AAV8载体,进一步优化使之在体内高效且稳定表达,克服了Ang-(1-7)半衰期短的特点,这为将Ang-(1-7)应用于临床研究提供新思路及新的理论基础。