研究背景：霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,约占全世界肿瘤年发病1%。其中经典型(CHL)占了HL的95%以上,CHL是一种起源于B细胞的单克隆样肿瘤,其少量的恶性成分Hodgkin/Reed-Sternberg(H/RS)细胞存在于具有大量炎细胞浸润的背景环境中。H/RS细胞的生存、增殖、免疫逃避、免疫调节机制与其周围的炎性背景细胞的关系密不可分。本课题组前期研究表明CD99下调对于H/RS细胞的形成起到至关重要的作用。人CD99(Mic2)是一个分子量为32KD的糖基化的跨膜糖蛋白,是HL的潜在致瘤基因,其功能尚未完全清楚,其可能参与血细胞分化及未成熟胸腺细胞的凋亡、肿瘤细胞的粘附与转移等。Janus kinase (JAK)/signal transducer and activators of transcription (STAT)是一条重要信号通路,具有信号转导和基因转录活化蛋白的作用,介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程,并活化相关靶基因,从而对细胞分化、成熟、增殖、凋亡等进行调节。研究表明,NF-KB和JAK/STAT信号通路是HL的两个最常见最重要的信号通路,STAT异常活化在HL形成中具有重要作用。而我们前期已经做过关于CD99与NF-KB信号通路之间的相互关系的初步研究,发现在HL中CD99与NF-KB成负相关；那么CD99与JAK/STAT信号之间又是什么关系呢?是本研究关注的焦点。目前至少已知有3种蛋白家族参与JAK/STAT信号转导的负向调节：即细胞因子信号传导的抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)、活化的STAT的蛋白抑制因子(protein inhibitor of activated STAT, PIAS)和包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸-1(SH2-containing tyrosine phosphatase-1, SHP-1),其中对SOCS的研究较为深入。SOCS家族通过介导JAK/STAT等信号通路参与多种细胞因子的负向反馈调节,从而影响细胞生长、增殖与凋亡。其家族共有8个成员：SOCS1-SOCS7和CIS。以SOCS1与SOCS3结构和功能研究最为清楚。国内外许多研究表明SOCS家族在人类多种系统多种疾病,尤其是肿瘤中发挥细胞因子介导信号转导的负向反馈调控作用,从某种程度上有效地阻止了疾病和肿瘤的进展。因此,以SOCS为靶标,通过特异性促进或阻断JAK/STAT通路治疗相关疾病将是研究的一个重点。SOCS1是JAK/STAT信号通路的反馈调控蛋白之一,可通过其SH2结构域与JAK (JAK1-3, TYK2)催化域的酪氨酸蛋白残基高亲和力结合,抑制其激酶活性。研究表明,SOCS1主要于胸腺中高表达,而在大多数肿瘤中则表现为基因沉默；在HL中因基因突变而表现为SOCS1低表达。SOCS-1基因被高甲基化后,JAK/STAT通路失去抑制,导致JAK/STAT持续活化。JAK/STAT的持续活化与肿瘤细胞的增殖及凋亡有关。SHP-1又称造血细胞磷酸酶(HCP)、SHPTP-1,SHP, PTP1C或PTPN6,主要表达于造血细胞的胞浆；是调节细胞内磷酸化水平的关键调控因子,其蛋白在正常组织中可以表现为正常表达或过度表达。SHP-1已被认为是白血病、淋巴瘤和其他肿瘤的抑癌基因。SHP-1调节机能障碍可导致细胞的过度增长,从而表现为各种肿瘤的发生。SHP-1基因甲基化导致SHP-1蛋白表达的减少和缺失被认为是淋巴瘤、白血病和其他肿瘤细胞的典型特征。因此淋巴细胞内SHP-1机能障碍会导致淋巴造血系统肿瘤的发生。本课题组前期研究表明CD99基因缺失和JAK/STAT信号通路的持续活化是CHL形成的重要机制。目前国内外关于SOCS1/SHP1的研究多集中在上皮性肿瘤如肺癌、胃癌、前列腺癌等,而HL中研究比较少,尤其是CD99与SOCS1/SHP1的关系在HL中目前未见报道。有研究报道,SOCS1可以通过作用于相邻的细胞膜表面受体来抑制细胞核内NF-KB信号通路的活性。那么在HL中CD99与SOCS1/SHP1这一肿瘤抑癌基因又是一个什么样的关系呢?它们与JAK/STAT信号通路之间又是怎样的调控关系呢?CD99是否可以通过SOCS1来调控JAK/STAT信号通路的活性呢?Hye Sook Min等提出在HL中CD99可能通过SOCS1、SHP1、PIAS3、CD45调控JAK/STAT信号通路的假设。为此,我们在以往的研究基础上采用荧光定量、western blot、免疫组织化学、Si-RNA片段瞬时干扰调节、信号通路抑制剂抑制、荧光共聚焦、MTS、细胞流式术、细胞凋亡等实验方法,首先在B淋巴瘤细胞株中筛选出目的因子SOCS1/SHP1,进而在CHL细胞株L428细胞中干扰及过表达调节CD99、SOCS1及抑制和激活JAK/STAT1信号通路,来探讨CD99与JAK/STAT1-SOCS1/SHP1之间的相互调控关系,通过荧光共聚焦对其进行共定位,从而进一步确定CD99与JAK/STAT1-SOCS1/SHP1之间的相互关系。同时,探讨STAT1、SOCS1对HL的生长、增殖与凋亡的影响。目的：1.观测B淋巴瘤细胞株IM9、KM3、L428、L428-CD99细胞中STAT家族和JAK/STAT负向调节因子的表达,比较分析CD99与目的因子SOCS1/SHP1的关系。观测已确诊的CHL石蜡组织中CD99、SOCS1、STAT1、SHP1的表达。2.对HL细胞株L428细胞瞬时干扰CD99基因及SOCS1基因,上调SOCS1基因,再运用信号通路抑制剂抑制及IL-3激活JAK/STAT信号通路,探讨CD99与JAK/STAT1-SOCS1/SHP1的相互关系。3.荧光共聚焦观测L428细胞中CD99、SOCS1/SHP1、STAT1三者蛋白表达的共定位,进一步探讨三者之间的相互关系。4.观测L428细胞瞬时干扰及过表达SOCS1,抑制STAT1后对瘤细胞的增殖、凋亡、周期的影响。方法：1.B淋巴瘤细胞株中STAT家族及其负向调节因子的检测B淋巴瘤细胞株：浆细胞株IM9细胞、KM3细胞、CHL细胞株L428细胞以及本课题组构建的上调CD99的稳定细胞株L428-CD99细胞进行细胞培养,观察细胞形态；提取RNA,荧光定量PCR检测STAT1-STAT6、SOCS1、SOCS3、 SHP1、PIAS3、CD45的mRNA表达；Western blot检测CD99、SOCS1/SHP1、 STAT1的蛋白表达。免疫组织化学实验在HL临床病理组织学上检测目的因子CD99、STAT1、SOCS1/SHP1的表达。2. SOCS1/SHP1与CD99、STAT1的关系L428-CD99、IM9、KM3细胞培养,Si-RNA瞬时干扰CD99,提取RNA,荧光定量PCR检测CD99、SOCS1/SHP1、STAT1mRNA的表达；western blot检测CD99、SOCS1/SHP1、STAT1蛋白的表达；L428细胞培养,瞬时干扰SOCS1及上调SOCS1基因,提取RNA,荧光定量PCR检测CD99、SOCS1、STAT1mRNA的表达情况；western blot检测CD99、SOCS1、STAT1蛋白的表达；同时应用JAK/STAT信号通路抑制AZD1480剂抑制及IL-3激活STAT1, western blot检测CD99、SOCS1/SHP1、STAT1蛋白的表达。3.CD99、SOCS1/SHP1、STAT1三者的共定位L428细胞培养,荧光共聚焦检测CD99、SOCS1/SHP1、STAT1在细胞中的表达部位,及三者之间的表达共定位。4.SOCS1、STAT1对HL的增殖、凋亡、周期的影响在L428细胞中抑制JAK/STAT1、过表达及下调SOCS1后,MTS法检测HL细胞株L428细胞的增殖情况,细胞流式检测SOCS1、STAT1在L428细胞凋亡、增殖及细胞周期中的作用。结果1.B淋巴瘤细胞株中STAT家族及其负向调节因子的表达(1)以IM9细胞为对照组,结果显示：KM3细胞中STAT1、STAT2、 STAT5mRNA表达水平较IM9细胞高,STAT3、STAT4、STAT6mRNA表达水平较IM9细胞低；L428细胞STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5mRNA表达水平较IM9细胞高,STAT6mRNA表达水平较IM9细胞低；L428-CD99细胞STAT1、STAT3、STAT4、STAT5mRNA表达水平较IM9细胞低,STAT2、 STAT6mRNA表达水平较IM9细胞高；两者相比均有统计学意义(P=0.000);KM3细胞SOCS1、SOCS3、SHP1、PIAS3mRNA表达水平与IM9细胞表达水平差异有统计学意义(P=0.000)；L428细胞SOCS1、PIAS3mRNA表达水平较IM9细胞高,SOCS3、SHP1、CD45mRNA表达水平较IM9细胞低；L428-CD99细胞SOCS1、SOCS3、SHP1、PIAS3mRNA表达水平较IM9细胞高,CD45mRNA表达水平较IM9细胞低；且二者之间差异有统计学意义(P=0.000)。(2)在L428细胞CD99、SOCS1mRNA表达水平较L428-CD99细胞表达水平低,而STAT1mRNA表达水平较L428-CD99细胞表达水平高,且差异有统计学意义(P=0.000)；而蛋白水平表达趋势与基因水平表达趋势相一致,在L428细胞CD99、SOCS1表达水平较L428-CD99细胞表达水平低,而STAT1表达水平较L428-CD99细胞表达水平高,且差异有统计学意义(P=0.000)。(3)免疫组化结果显示：SOCS1在23例临床确诊的CHL石蜡组织中阳性率为21.7%(5/23),在14例临床确诊的弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)石蜡组织中不表达(0/14),且二者相比有同学意义(p=0.000); SOCS1在正常组织(脾脏)中不表达。在CHL组织中,CD99在H/RS细胞不表达,CD99主要表达于背景细胞的包膜,部分浆表达；SOCS1为局部小灶状表达,主要表达于瘤细胞的胞浆；STAT1为高表达,主要表达于瘤细胞的胞浆；SHP1弱表达或无表达。2.SOCS1/SHP1与CD99、STAT1的关系(1) IM9、KM3、L428-CD99细胞中Si-RNA瞬时干扰CD99, RT-PCR及western blot检测：下调CD99后,在IM9、KM3、L428-CD99三株细胞中STAT1在基因和蛋白水平表达均增高,差异有统计学意义(P=0.000)；而SOCS1/SHP1在基因和蛋白水平表达均降低,差异有统计学意义(P=0.000)。(2)L428细胞中AZD1480信号通路抑制剂抑制JAK/STAT1信号通路,western blot检测：加入AZD1480组中,STAT1、SOCS1蛋白水平表达较裸细胞组和加入PBS组蛋白水平表达降低,而CD99蛋白水平表达较裸细胞组和加入PBS组蛋白水平表达增高。(3) L428、L428-CD99细胞中IL-3激活JAK/STAT1信号通路,30min后收集蛋白,western blot检测加入IL-3处理组,P-STAT1、SOCS1蛋白水平表达较裸细胞组和加入PBS组蛋白水平表达均增高,而CD99蛋白水平表达较裸细胞组和加入PBS组蛋白水平表达降低。(4)L428细胞中Si-RNA瞬时干扰SOCS1, RT-PCR及western blot检测：下调SOCS1后,STAT1在基因和蛋白水平表达均增高,差异有统计学意义(P=0.000)；而CD99在基因和蛋白水平表达均降低,差异有统计学意义(P=0.00)。(5)L428细胞中过表达SOCS1, RT-PCR及western blot检测：过表达SOCS1后,CD99在基因和蛋白水平表达均增高,差异有统计学意义(P=0.000)；而STAT1在基因和蛋白水平表达均降低,差异有统计学意义(P=0.00)。3.CD99、SOCS1、STAT1三者的共定位L428细胞株中荧光共聚焦检测显示：CD99主要为细胞膜表达,部分浆表达；SOCS1主要表达于细胞浆,STAT1主要表达于细胞浆。粉红色部分为CD99、STAT1、SOCS1三者表达共定位部位。而SHP1为浆表达,CD99、STAT1、SHP1三者之间共定位发现粉红色为三者表达共定位部位。4.SOCS1、STAT1对HL细胞的增殖、凋亡、周期的影响L428细胞株中Si-RNA瞬时干扰SOCS1及AZD1480抑制JAK/STAT1,MTS、细胞流式检测细胞周期与凋亡,检测结果显示：抑制JAK/STAT1后,L428细胞增殖率降低,细胞周期停留在S期(51.73%)。细胞凋亡比例增加；L428裸细胞组细胞凋亡率为5.15%,PBS组细胞凋亡率为7.95%,而AZD1480组细胞凋亡率为36.35%。瞬时干扰SOCS1后L428细胞增殖率增加；细胞周期停留在S期(49.98%)；细胞凋亡降低,裸细胞组细胞凋亡率为3.96%,空载组细胞凋亡率为4.15%,而干扰组细胞凋亡率为2.81%。过表达SOCS1后L428细胞增殖率降低；细胞周期停留在G1期(52.92%)、S期(36.92%)；细胞凋亡比例增加,裸细胞组细胞凋亡率为3.80%,空载组细胞凋亡率为9.31%,而过表达组细胞凋亡率为20.78%。结论1.SOCS1、SHP1的表达与CD99的表达有一致性。2.CD99表达与STAT1表达成负向关系,SOCS1/SHP1与STAT1表达成负反馈调节关系。3.CD99通过作用于SOCS1/SHP1负向调控JAK/STAT1。4.STAT1在HL持续高表达促进肿瘤细胞的增殖、降低其凋亡。5.在L428细胞中SOCS1低表达促进肿瘤细胞的增殖、降低其凋亡；过表达促进肿瘤细胞的凋亡,并降低其增殖。以SOCS1为靶点,通过抑制JAK/STAT信号通路治疗肿瘤的形成很可能成为HL治疗的一个靶点。创新之处1.本研究运用JAK/STAT信号通路负向反馈调控靶点机制,首次探究了SOCS1/SHP1及STAT1在HL细胞株L428细胞的表达及其意义。2.研究证实了CD99-SOCS1-STAT1调控环路,为H/RS细胞与微环境的研究奠定一定的理论和实验基础。