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1997年0’Reilly等发现了一种能在抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖的蛋白质，命名为内皮抑素(Endostatin)。内皮抑素能够抑制血管内皮细胞生长，进而抑制新生血管生长，使得肿瘤的新生血管生成受限而抑制肿瘤生长和转移。人血管内皮抑素是由184个氨基酸组成，分子量约为18.5KD，可以明显抑制新生血管的生成，从而抑制肿瘤的生长和转移，取得了较好的治疗效果，美国FDA已批准内皮抑素用于临床试验阶段。因此研制开发重组人内皮抑素(rhES)对于防治肿瘤和其它病理性血管增生疾病都具有良好的临床应用价值。由于人内皮抑素天然来源非常有限，取材困难，产量甚微，远不能满足临床应用的需要，因此应用DNA重组技术大量生产人内皮抑素势在必行。本实验室应用重组质粒PCX／hendostatin在大肠杆菌BL21中高效表达了人内皮抑素，但其以不溶解的包涵体形式存在，而对其进行纯化和复性的工作显得较为困难，并且纯化回收蛋白过程中损失大；而在哺乳动物细胞中表达人内皮抑素的表达量又很低，因此如何寻找一种高效表达人内皮抑素的表达系统显得十分重要。毕赤巴斯德酵母(pichia.pastoris)表达系统作为一种新型外源基因表达系统，具有原核表达系统良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的优点，故而成为外源基因表达到理想宿主。 本实验共分为两个部分： 一、重组人内皮抑素(endostatin)在毕赤酵母中的表达，纯化及其体外生物学活性检测 将线性化重组质粒pPIC9／hendostatin用氯化锂法转化入感受态酵母宿主细胞基因组中，筛选出转化株表型的表达菌株进行诱导表达后，用银染鉴定，表明实验成功地将重组质粒pPIC9／hEndostatin整合入酵母基因组，并获得rhES的高效分泌表达。用Western-blot鉴定筛选表达产物的抗原性表明表达产物rhES具有抗原活性。用Hitrap heparin HP肝素亲和层析的方法对表达产物进行了纯化，薄层扫描目的蛋白纯度达90％以上。采用MTT比色法检测到纯化的rhES具有良好的生物学活性，能够抑制bFGF刺激的ECV-304细胞的增殖。 二、重组人内皮抑素hhES）的大量表达纯化及其抑制人肺腺癌As比一a—1生长和转移的实验观察 通过挑取筛选得到的高效表达转化子，进行培养诱导获得了大量表达后，用Hitrap heparin层析柱从上清液中纯化收集重组人内皮抑素，SDS干AGE分析显示分子量约18．SKD的单一条带，纯度达印％以上。采用本方法可以大量表达并通过纯化获得纯度较高的rhES。将已接种人肺腺癌细胞的裸鼠30只分为rhES治疗组和PBS治疗组两组，rhES治疗组每 R给予 rhES20ms／ks／d；PBS对照组给予等量的 PBS皮下注射，连续14天。对照组与治疗组小鼠的生存时间分别为28．867土1．126d和42．667土1．780d，存在显著性差异叩的．001），人内皮抑素治疗组的原位肿瘤发现肿瘤包膜完整，肉眼未见对周围组织的浸润和转移，病理切片见肿瘤组织出现大片坏死，肿瘤细胞萎缩，胞浆破裂，血管少；而在PBS对照组中肿瘤侵蚀周围的肌肉、骨等组织，肿瘤与周围组织界限不明显，手术分离肿块困难，病理切片见肿瘤少量坏死，主要位于肿瘤的中心部位，肿瘤细胞生长良好，血管清晰可见。治疗组肿瘤大小在治疗前是 0．163上 0．027cm‘，经重组人内皮抑素治疗 14d后，肿瘤大小为 0．839土口．058cm‘；而 PBS对照组治疗前后肿瘤大小分别为 0．158土0．019cm’和5．277土0．08Icm’，人内皮抑素治疗组的肿瘤增长较对照组显著减慢。治疗组小鼠的肺表面和切面上均未见肿物，病理切片未见肺腺癌细胞；对照组的肺标本未见肿物，但病理切片上肺组织内存在肺腺癌细胞，呈散在分布或聚集成小四块。上述所见充分说明本实验第一部分实验得到的rhES具有抑制肿瘤血管内皮细胞生长的活性，从而抑制肿瘤生长和转移。