胚胎软骨分化因子1((Differentiated embryo-chondrocyte1, DEC1)是bHLH家族成员之一,参与体内神经生成、肿瘤生成、软骨发育、低氧应激和代谢综合症发生等多个过程。近来,有研究发现DEC1在肌肉发育和脂肪沉积方面同时发挥着重要作用,而肌肉发育和脂肪沉积是肉用家畜最重要的两个性状。因此,DEC1基因很可能是影响肉牛经济性状的重要遗传标记基因,而其影响肌肉发育和脂肪沉积的分子机制研究也非常必要。基于此,本研究利用荧光定量PCR、基因克隆、腺病毒包装、Western blot、细胞免疫荧光、细胞培养以及双荧光素酶报告系统等实验技术,综合分析了牛DEC1在肌肉发育和脂肪生成中的作用及其分子机制,研究内容包括牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定,牛DEC1基因在不同组织及肌卫星细胞分化过程中表达模式分析,DEC1诱导剂CoCl2对牛肌卫星细胞分化的影响,牛DEC1基因的克隆及对牛肌卫星细胞分化的调控,牛MyoG基因启动子活性分析及DEC1对MyoG启动子活性的调控,过表达DEC1对脂肪细胞分化的影响及其调控机制,牛DEC1基因多态性及其与生长性状的关联分析。本研究主要取得了以下结果：1.牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定用Ⅰ型胶原酶消化法分离得到牛肌卫星细胞,细胞免疫荧光鉴定结果显示肌卫星细胞标志基因Pax7表达呈阳性,用含2%马血清的诱导分化培养基可将其诱导成肌管,表明该方法得到的肌卫星细胞可以作为下一步骨骼肌发育调控机制研究的细胞模型。2.牛DEC1基因在不同组织及肌卫星细胞分化过程中表达模式分析采集胚胎期、新生期和成年期3个发育阶段秦川牛的心、肝、肺、肾、脂肪、肌肉、胃、大肠8个组织,利用qRT-PCR方法对这些组织的DEC1基因mRNA表达量进行了分析,发现DEC1在各组织中广泛表达,并首次揭示了在肌肉和脂肪组织中DEC1的表达随年龄增长呈下降趋势。DEC1在生肌卫星细胞分化过程中的表达模式研究发现DEC1基因mRNA表达量在牛肌卫星细胞分化过程中呈下调趋势,说明DEC1很可能是肌卫星细胞分化的负调控因子。3. CoCl2诱导DEC1表达同时抑制牛肌卫星细胞分化分别在正常生长和诱导分化条件下,用CoCl2处理牛肌卫星细胞发现均能显著诱导DEC1基因表达上调,表明CoCl2可以作为DEC1基因的有效激活剂。同时,首次检测了CoCl2对肌卫星细胞分化的影响,发现虽然在生长培养基条件下,CoCl2处理对牛肌卫星细胞不影响肌分化标志基因表达,但在诱导分化条件下,CoCl2处理能够抑制牛肌卫星细胞中肌分化标志基因表达。4.牛DEC1基因的克隆及对牛肌卫星细胞分化的调控从秦川牛肌肉组织cDNA中克隆得到牛DEC1基因cds区序列,将牛DEC1蛋白序列与10个物种DEC1蛋白序列比对发现,DEC1在进化上比较保守,进化树结果表明牛DEC1与绵羊的遗传距离最为接近。用得到的DEC1基因cds序列成功构建DEC1过表达腺病毒载体,经过包装、扩繁得到DEC1过表达的病毒液。将该病毒液感染牛肌肉卫星细胞,发现过表达DEC1能够抑制肌分化相关基因的表达,同时抑制肌卫星细胞的分化。5.牛MyoG基因启动子活性分析及DEC1对MyoG启动子活性的调控克隆得到秦川牛MuoG启动子片段,构建5个缺失片段报告基因载体,利用荧光素酶报告系统分析了5个缺失片段的活性,发现pGL3-MyoGpro1117片段活性最高。而在DEC1过表达时,MyoG启动子活性显著降低,首次揭示了DEC1可以抑制MyoG启动子活性,从而进一步抑制MyoG基因的表达。6.过表达DEC1抑制脂肪细胞分化并下调PPARg基因的表达用包装好的DEC1过表达腺病毒液感染牛前体脂肪细胞,发现脂肪细胞分化受到抑制,同时PPARg,FABP4和HSL基因的表达下调。启动子活性分析试验也表明,DEC1过表达时,PPARg启动子活性显著降低。7.牛DEC1基因多态性及其与生长性状的关联分析在5个牛品种共1226份样品中扫描DEC1基因全部编码区的多态性,在第5外显子发现两个突变,分别为BamHI(EX5+114T>C)和ApaI(EX5+733A>G).其中BdmHI突变位点(EX5+114T>C)与南阳牛18月龄日增重显著相关(P<0.05)。