背景随着社会老龄化加剧,钙化性主动脉瓣膜疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)发病率日益增加,但其具体发病机制尚不清楚。近年来的研究表明,CAVD是一个主动的、多细胞参与并受复杂机制调控的成骨样分化过程。基质Gla蛋白(matrix gla protein,MGP)是血管钙化的强效抑制剂,其在心脏瓣膜内也有表达。有研究表明,在血管钙化过程中,内源性MGP表达量减少,且其羧化作用受损,继而其抑制钙化的能力减弱。然而,关于MGP在主动脉瓣膜钙化过程中的变化调节情况的研究较少。目的研究基质Gla蛋白(MGP)在主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)体外钙化诱导过程中的变化情况。方法1.分离、培养主动脉瓣膜间质细胞:取健康成年雄性家猪,采用电击法处理,待家猪完全晕厥后,放血、剖开胸腔,取下主动脉根部,保存在预冷过的生理盐水中,迅速返回实验室。严格无菌条件下,剪下主动脉瓣膜,并剪碎瓣膜组织,采用组织块法分离培养瓣膜间质细胞,每2-3天更换一次培养基。取2-5代AVICs以1×105/m L的细胞密度分别种植于6孔板中,在标准培养基和钙化诱导培养基(含2 m Mβ-甘油磷酸,100 n M地塞米松,50μg/m L维生素C)中培养。分别在1、7、14d收集两组瓣膜细胞,用于后续实验。2.免疫荧光染色鉴定原代分离培养的细胞表型:取分离培养所得瓣膜细胞,消化后加入培养基制成细胞悬液,调整细胞密度至1×105/m L,滴加到预先处理过的玻片上,进行爬片。待细胞贴壁后,即可采用免疫荧光染色技术检测细胞内波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血管性假血友病因子(v WF)的表达情况。3.茜素红染色及钙化结节计数法观察正常对照组与钙化诱导组细胞在1、7、14d的钙化情况及钙化结节数。4.采用Real Time-PCR、Western Blotting法分别测定正常组与钙化诱导组细胞在处理1、7、14d后MGP mRNA表达水平及活化型MGP蛋白含量。结果1.原代细胞培养及表型鉴定结果:细胞均呈梭形,旋涡状排列;免疫荧光染色结果:波形蛋白、α-SMA染色阳性,v WF阴性,表明培养细胞为成纤维表型。2.茜素红染色及钙结节计数结果:分别检测对照组与钙化诱导组细胞在1、7、14 d的钙化情况,对照组细胞在7、14 d出现少量钙化结节(2.38±0.97个/孔、5.47±1.59个/孔),钙化诱导组7、14 d出现明显钙化(37.55±6.70个/孔、78.29±9.14个/孔),钙化诱导组细胞在7、14 d钙化情况明显高于同一时间点对照组钙化情况(P<0.05)。3.RT-PCR检测结果:7、14 d时,钙化诱导组细胞内MGP mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)。4.Western Blotting检测结果:7、14 d时,钙化诱导组内活化型MGP蛋白含量水平明显低于对照组(P<0.05)。结论在钙化诱导条件下,AVICs内钙化抑制剂MGP抑制钙化能力下调。