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目的:糖尿病神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一,其发病率逐年增高,感觉神经病变即糖尿病神经痛性病变是其中最为常见的,约占30％,其发病机制及病理生理机制十分复杂。脊髓背角的各种神经递质和受体在糖尿病神经病理性痛等慢性疼痛时可发生一系列改变。NMDA受体是一种配体门控离子型谷氨酸受体,是兴奋性氨基酸受体系统的重要组成部分。NMDA受体不仅参与学习记忆、突触可塑性及神经发育等生理功能的调节,而且,在疼痛、神经退行性变、癫痫等病理过程中发挥重要作用。NMDA受体是由NR1和NR2亚单位组成的异五聚体。NR2B亚单位对NMDA受体的结构和功能起着十分重要的作用,通过多种方式调节NMDA受体的功能活性,其改变将影响机体NMDA受体系统的功能,进而影响痛觉信息在脊髓背角的整合、传递和调控。本实验通过左下腹腔注射链尿佐菌素(STZ),制备糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型。观察比较糖尿病大鼠(DM)与正常大鼠(Control)在体重、空腹血糖和50％缩足反应阈值(PWT)等方面的变化。采用免疫组织化学染色方法,比较糖尿病神经痛大鼠与正常大鼠脊髓背角NR2B的表达变化,从而探讨NR2B在糖尿病神经病理性痛形成中的变化及作用,以期发现新一代治疗慢性疼痛药物的治疗靶点。
方法:
健康雄性SD大鼠60只,体重130克～150克,实验前测定所有大鼠的体重、空腹血糖和50％缩足反应阈值(PWT)。随机取48只大鼠左下腹腔注射STZ(60mg/kg)制备糖尿病模型。STZ注射7天后,30只大鼠所测空腹血糖＞16.7mol/L,为成功的糖尿病大鼠模型,其余18只大鼠空腹血糖＜16.7mol/L被剔除实验,模型制备成功率为:63％。STZ注射14天后,用von Frey针测定大鼠的50％缩足反应阈值(PWT),PWT小于4g者为糖尿病神经痛大鼠模型。另外12只正常大鼠腹腔注射相同量的生理盐水(C组),用作与注射STZ相对比的正常对照组。
随机取糖尿病神经痛大鼠20只(D组)和正常大鼠12只(C组)进行行为学及分子生物学实验。确定4个取材点,分别定为注射STZ后2周、3周、5周、7周。根据取材时间点不同,将20只D组大鼠分成4组(n=5):D2组、D3组、D5组、D7组;12只正常大鼠也分为4组(n=3):C2组、C3组、C5组、C7组。两组分别于腹腔注射后2周、3周、5周、7周测量各大鼠的体重、空腹血糖及50％缩足反应阈值变化,然后取材。大鼠取材时,均用4％多聚甲醛灌流固定,取脊髓胸腰段膨大处置于4％多聚甲醛固定,蜡块包埋,进行免疫组织化学染色,测定大鼠脊髓背角NR2B的免疫阳性神经细胞数。所得数据以平均数士标准差(x-±s)表示,采用SPSS17.0统计软件包进行秩和检验、单因素方差分析、组内t检验和相关性分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果:
1：两组大鼠在体重、空腹血糖、50％缩足反应阈值方面的变化比较(见附表):腹腔注射前,两组大鼠在体重、空腹血糖及50％缩足反应阈值方面的无显著性差异(P＞0.05)。两组大鼠各对应时间点相比,D组大鼠体重明显较C组大鼠降低(p＜0.05),D组大鼠空腹血糖明显较C组大鼠增高(0＜0.05),D组大鼠PWT明显较C组大鼠降低(p＜0.05)。
2：NR2B在大鼠脊髓背角的表达变化(见附表):与C组正常对照组相比,D组注射STZ后2周、3周、5周、7周的糖尿病神经痛大鼠脊髓背角NR2B免疫阳性神经元细胞数明显增加(p＜0.05),在3周时NR2B免疫阳性.神经元细胞数量达到最多,5周时开始出现下降,在7周时明显下降。
结论:
脊髓背角NR2B在脊髓水平参与调节了大鼠糖尿病神经病理性痛的调节。