心肌肥大是心脏对多种病理刺激产生的一种适应性反应，心肌肥大最终走向心衰，引起病人死亡。其病理变化表现为胚胎基因如心钠肽、脑钠肽和β-肌球蛋白重链等表达增加、蛋白合成增加、心肌细胞体积增大、肌原纤维重构等。　　 肿瘤坏死因子是一具有多种效应的炎症性细胞因子，晚期心衰患者血清中TNF-α水平升高，在各种心肌功能损伤(如心衰有关的炎性与肥大等)的情况下都会过量表达，由心肌细胞和存在于心脏的巨噬细胞分泌，参与许多心肌病变的发生过程。TNF-α是一种重要的促心肌细胞肥大因子，它引起心肌细胞肥大的机制目前尚不清楚。　　 针对TNF-α的抗心衰治疗措施是心衰治疗领域的一个研究热点。大分子蛋白类TNF-α抑制剂具有特异性好、结合能力强的特点，但也存在着稳定性较差，在患者体内易降解并极易产生免疫耐受、不良反应明显等特点。因此，探索新的免疫抑制剂研究策略来研制靶向抗TNF-α的小分子药物或针对受体特定区域的小分子多肽，已成为当前TNF-α抑制剂研发的热点。针对此靶点的化学小分子类药物尽管理论上讲应当是最理想的药物，但目前以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板进行计算机辅助药物设计及虚拟筛选并没有研发出理想的抗TNF-α的抑制剂。短肽抑制剂，由于分子量较小、作用区域明确，被认为是一类较为理想的新型TNF-α受体拮抗剂。以这些肽为前导物，依据它们的功能基团的组成及功能基团的空间构象，合成与它们具有相同构象的非肽小分子模拟物，可以在新型抗心衰药物的开发中起导向作用。　　 在心肌肥大发生发展过程中，细胞内钙信号传递途径是诱导心肌肥大的最重要信号转导通路之一。胞内Ca2+增加是致心肌肥大的最基本信号，胞内Ca2+增加激活钙/钙调素依赖的蛋白激酶，激活下游信号通路，活化多种心肌肥大的相关基因，从而引起心肌肥大。其中，钙调神经磷酸酶信号通路在胞内Ca2+升高诱导的心肌肥厚发生发展过程中起关键性的作用。细胞内Ca2+浓度的升高可以激活CaN，继而使胞质中活化T细胞核因子去磷酸化，去磷酸化的NFATc4通过暴露其上的核定位信号，转位入细胞核，再与心肌细胞核内的转录因子如锌指转录因子(GATA4)相互作用，活化多种心肌肥大的相关基因，调节心脏中ANF、BNP等肥大基因特异性表达，导致心肌肥大。　　 研究表明，TNF-α能通过干扰心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)，降低钙瞬变从而抑制心肌细胞收缩，但TNF-α对心肌细胞[Ca2+]i的影响尚不明确。　　 Pep 3(LRENECVS)是本实验室根据Ⅰ型TNF-α受体(TNF-R1)细胞外区域亚功能域CRD4区域设计，从多个序列中筛选出的一条优选小肽(Pep 3序列已申请国家专利保护，申请号：200810218732.2)，是一种多肽类TNF-α受体拮抗剂，前期研究表明其能够显著抑制TNF-α和TNF-R1的结合。本文设想TNF-α能够通过Ca2+-CaN-NFATc4信号通路诱导心肌细胞肥大，而Pep 3能抑制TNF-α的这种作用，从而为开发新型抗心衰药物提供理论导向。　　 本课题分两部分进行。　　 第一部分建立TNF-α诱导培养的乳鼠心肌细胞肥大模型，确定刺激的浓度和时间。　　 第二部分采用上述细胞模型观察Pep 3是否有抑制TNF-α诱导的心肌细胞肥大的作用，并探讨其可能的作用机制。　　 第一节、TNF-α诱导乳鼠心肌细胞肥大模型的建立研究目的建立TNF-α诱导培养SD大鼠乳鼠心肌细胞肥大模型。　　 研究方法：　　 1.采用本室建立的改良法培养SD乳鼠心肌细胞。　　 2.采用荧光定量PCR检测肥大基因ANF和BNP mRNA表达水平。　　 3.倒置相差显微镜观察刺激后心肌细胞表面积的变化并统计分析。　　 结果：细胞表面积测定结果显示，TNF-α(10-50ng/ml)可以浓度依赖性地增加乳鼠心肌细胞表面积，其中25 ng/ml有统计学意义(P＜0.05，vs空白对照组)。TNF-α(25 ng/ml)可以时间依赖性地诱导心肌表面积增加，刺激24小时最为明显(P＜0.05，vs空白对照组)。荧光定量PCR结果显示，TNF-α(25 ng/ml)可以时间依赖性地诱导心肌细胞ANF和BNP mRNA表达水平升高，12小时和24小时有统计学意义(P＜0.05，vs空白对照组)，而48小时恢复至正常水平。　　 结论：本文成功建立TNF-α诱导培养新生SD大鼠心肌细胞肥大模型，模型的建立条件为：25 ng/ml TNF-α作用于心肌细胞24小时。　　 第二节、Pep 3对TNF-α诱导乳鼠心肌细胞肥大的影响及相关信号通路研究。　　 研究目的：观察Pep 3对TNF-α诱导乳鼠心肌细胞肥大反应的作用，并探讨TNF-α诱导心肌肥大反应的机制。　　 研究方法：　　 1、采用MTT的方法检测细胞存活率观察在乳鼠心肌细胞使用Pep 3的安全浓度。　　 2、实验分为五组，分别为空白对照组、细胞肥大模型组、Pep 3低剂量组、Pep 3中剂量组、Pep 3高剂量组。空白对照组不予以任何刺激，细胞肥大模型组以25 ng/ml TNF-α刺激，其余三组分别以30μM、60μM和120μM的Pep 3与25 ng/ml TNF-α室温预孵育1小时后进行刺激。　　 3、通过倒置相差显微镜观察观察细胞表面积和荧光定量PCR方法观察TNF-α刺激后心肌细胞的肥大反应以及Pep 3对其的影响，观察Pep 3是否具有抑制心肌细胞肥大的作用。　　 4、以Fluo-4/AM为探针，采用激光共聚焦显微镜(confocol microscopy)检测心肌细胞[Ca2+]i和钙瞬变情况，探讨Pep 3抑制TNF-α诱导的心肌细胞肥大是否与Ca/2+作用相关。　　 5、采用荧光定量PCR和Western blot方法检测各组细胞CaN的表达，免疫荧光方法检测NFATc4的核转位情况，探讨Pep 3抑制TNF-α诱导的心肌细胞肥大作用是否和CaN-NFATc4通路有关。　　 结果：　　 1、3 μM-270 μM的Pep 3对乳鼠心肌细胞活力没有显著影响。　　 2、25 ng/ml TNF-α作用24小时可显著诱导心肌细胞表面积的增大[(1.78±0.2)倍，P＜0.05，vs空白对照组]，而Pep 3在30 μM-120 μM范围内以浓度依赖性方式抑制了抑制了TNF-α诱导的心肌细胞表面积增大[30 μM，-93.8％，P＞0.05；60 μM，-73.0％，P＜0.05；120 μM，-69.1％，P＜0.05，vs模型组]。同时，荧光定量PCR的结果显示，25 ng/ml TNF-α显著诱导了ANF、BNP mRNA在心肌细胞的表达[分别为(2.43±0.17)倍和(2.77±0.12)倍，vs空白对照组，P＜0.05]，而Pep 3预处理1小时以浓度依赖性的方式阻止了TNF-α的这种作用(30 μM，-87.1％，P＞0.05；60 μM，-73.2％，P＜0.05；120μM，-51.4％和30μM，-90.8％，P＞0.05；60 μM，-57.8％，P＜0.05；120μM，-48.6％，vs模型组，P＜0.05)。　　 3、25 ng/ml TNF-α作用于心肌细胞30分钟，可升高舒张期细胞内Ca2+浓度[(1.41±0.26)倍，vs空白对照组，P＜0.05]，Pep 3预处理1 h抑制了TNF-α所致的Ca2+浓度升高(30 μM，-108％，P＞0.05；60 μM，-72.3％，P＜0.05；120μM，-67.8％，vs模型组，P＜0.05)。　　 4、25 ng/ml TNF-α作用于心肌细胞30分钟，可使心肌细胞钙瞬变降低，Pep 3预处理1小时抑制了TNF-α的这种作用。　　 5、25 ng/ml TNF-α刺激24小时后CaN mRNA表达较对照组明显增加[(1.81±0.12)倍，vs空白对照组，P＜0.05]，Pep 3预处理1小时以浓度依赖性方式抑制了TNF-α的这种作用(30 μM，-97.9％，P＞0.05；60 μM，-87.3％，P＜0.05；120 μM，-71.3％，vs模型组，P＜0.05)；CaN蛋白表达亦明显增加[(1.77±0.06)倍，vs空白对照组，P＜0.05]，Pep 3预处理1小时同样抑制了TNF-α的这种作用(30 μM，-98.2％，P＞0.05；60μM，-86.5％，P＞0.05；120 μM，-65.0％，vs模型组，P＜0.05)。　　 6、TNF-α刺激1小时后心肌细胞中NFATc4开始进入细胞核。随着刺激时间延长，发生核转位的细胞数量增加，刺激3小时最为明显。Pep 3预处理1小时阻止了TNF-α诱导的NFATc4由胞浆到胞核的转位。　　 结论：Pep 3在3 μM-270 μM的范围内对培养的乳鼠心肌细胞无明显毒性。TNF-α诱导乳鼠心肌细胞肥大可能与升高细胞舒张期钙离子水平，激活calcineurin-NFATc4信号通路有关；Pep 3预处理可抑制TNF-α诱导的乳鼠心肌细胞肥大，该保护作用提示TNF-R1 CRD4在TNF-α与其受体识别并发挥效应中亦起了重要作用。