酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TRP-1)是黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中含量最丰富的糖蛋白，其基因是第一个克隆成功的色素基因。由于该蛋白与酪氨酸酶有一定的同源性，因而被称为酪氨酸酶相关蛋白—1。多年来人们对人TRP-1的功能一直有争议。近来通过对鼠TRP-1功能的研究，证明该蛋白具有5,6-二羟吲哚羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid,DHICA)氧化酶活性，在黑素合成的下游途径中起重要作用。但研究表明DHICA不是人TRP-1的底物，此外，一些研究观察到黑素细胞在抗氧化压力能力下降、早死的同时伴有TRP-1基因表达的异常。因此推测TRP-1与黑素细胞的变性和死亡相关，也参与黑素形成过程中系统毒性物质的清除，但是至今尚无直接的证据，TRP—1的功能仍有待于进一步的研究。 尽管国内外缺乏这方面的研究，但已发现黑素细胞中发生的某些分子事件与TRP-1有关，把黑素细胞和恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)细胞暴露于UVB下，细胞的酪氨酸酶活性增强，黑素合成增加，TRP-1的mRNA和蛋白表达提高。而从白癜风患者的病变边缘取材建立人黑素细胞系，其黑素细胞同正常黑素细胞相比具有较大的核周 第四军医大学俗士学位论文一 质及短而粗的树突，在MTT实验中表现为异常反应，当暴露于紫外线或受到热休克而使细胞氧化张力增加时，表现为细胞早期死亡，同时检测到Tny－lmRNA的降低。在白缀风的移植治疗研究中，有学者发现高浓度的角质形成细胞会抑制黑素细胞TRP－1 的表达，同时导致移植黑素细胞的消失，这些现象提示TRPl在调节黑素细胞生长和维持细胞自身稳定等方面发挥重要作用。TRP－1 不仅参与黑素的合成代谢，也参与黑素形成过程中系统毒性物质的清除，影响黑素细胞的增殖和死亡【‘－‘’］。但是由于目前对其功能的认识还非常有限，有些推论来自于对实验现象的解释，还没有直接的证据证明以往观察到的现象是 “因”还是“果”。 本研究旨在克隆TRP－l编码基因的。DNA序列，并构建其反义真核表达载体及稳定表达的小干涉 RNA（small interference RNA，siRNA）载体，通过基因转染，在黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中封闭TRPq表达，观察其生物学行为的变化情况，以探讨TRP刁表达在黑素细胞及恶性黑素瘤细胞中的作用。主要实验方法及结果包括： 一、T旺l编码基因的克隆及其反义核酸转染的正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞株的建立 利用同位酶进行亚克隆，将目的基因反向亚克隆至真核表达载体pCDNA3．1，构建其反义真核表达载体PCDNA3．1汀nyl（－）并进行酶切鉴定。脂质体介导反义重组载体及空载体分别转染Tgn刁高表达的人正常黑素细胞及人黑素瘤细胞系Libr，各种细胞分别命名如下：TRP反义核酸转染的黑素瘤细胞几ibr Tny上，Libr－AS人空载体转染的黑素瘤细胞（Libf今CDNA3．l，LibfP人 TRpl反义核酸转染的黑素细胞（melanocytes TRP上，MC－AS）及空载体转染的黑素细 ·3· 第四军医大学傅士学位论文 胞（melanocytes－pcDNA3．1，MCP） RT一PCR及 Western blot证％：在TRP．l反义核酸瞬时转染的人黑素细胞及稳定转染的人黑素瘤细胞系Libr中Tny刁的蛋白及mRNA水平均下调。Tny－1反义核酸转染的人正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞株方法建立成功。 二、TRP－l表达与正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞细胞生物学行为的关系研究 在黑素细胞和恶性黑素瘤细胞中封闭Tnyl表达后，我们观察了包括细胞增殖与凋亡、黑素合成功能及细胞形态学等方面的细胞生物学行为的变化情况。 1．Tny－l反义核酸对正常黑素细胞及黑素瘤细胞增殖与凋亡的影响 Libr－AS与 Libr－P；MC叭S与 MCP分别行 MTT比色试验，依据测定的A490值，绘制生长曲线。Tny－1反义核酸转染的黑素细胞和黑素瘤细胞分别在细胞生长曲线中显示增殖速度低于亲本细胞。MC－P。MC—AS和 MM－AS、MM－P洗涤固定染色后，以流式细胞仪测定细胞DNA含量，分析细胞周期的改变。结果显示反义核酸转染的黑素细胞及黑素瘤细胞发生了明显的 GI期细胞周期阻滞。接种 1000个充分消化的对数生长期的Libr－AS及Libr－P，出现肉眼可见克隆时染色后并计数克隆数，TRPl反义核酸转染的黑素瘤细胞克隆形成率显著降低。电镜观察转染细胞的超微结构，可见凋亡小体：转染细胞无血清培养饥饿 48小时后以 PI和 Annexin双重标记，经流式细胞仪检测发现转染 的黑素细胞及黑素瘤细胞凋亡明显高于对照细胞，与转染的黑素瘤细胞相比，转染黑素细胞凋亡和死亡都更加明显。每组三只裸鼠，取对数生长期的转染组细胞Libr－AS、对照组Libr－P及未转染的细胞Libr各 4X 10’，接种于裸鼠背部皮下。30天后，三组裸鼠移植瘤平均重量 ·4· 第四军医?