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兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)是一种具有强烈感染性和致死性的动物病毒,它属于杯状病毒科,兔病毒属。深入研究RHDV致病机理对于更好地防控该病具有重要意义。衣壳蛋白是RHDV最重要的一种结构蛋白,它不仅决定了病毒的免疫原性,在侵染宿主,感染致病等方面也发挥重要的作用。迄今,关于衣壳蛋白与RHDV的侵染性和病毒的复制等之间的关系还不清楚。鉴于此,我们拟在前期研究基础上,利用反向遗传学技术研究衣壳蛋白与RHD病毒的侵染性和病毒基因组复制等之间的关系。首先,我们在已建立的RHDV全长cDNA(PBLRHDV)的基础上,利用定点突变技术,分别在5325nt和6393nt制造点突变,分别产生两个NarI限制性内切酶识别位点,然后使用NarI消化PBLRHDV,再使用T4DNA连接酶重新连接,获得删除VP60大部分编码区的重组突变体(PBLRHDVd5325-6931),同时,还构建了VP60完全缺失的RHDV突变体(PBLRHDVdVp60)。通过体外转录,获得RHDV突变体RNA,将之转染RK13细胞,同时与完整病毒RNA进行对比。分别利用间接免疫荧光、RT-PCR和实时定量PCR等方法检测衣壳蛋白缺失突变后,对病毒的侵染性和病毒基因组复制等方面的影响。研究表明,突变体RNA转染细胞后,仍能拯救出病毒,且再次接种正常RK13细胞,仍能产生明显细胞病变(CPE),表明病毒缺失衣壳蛋白后仍具有侵染能力。应用RT-PCR方法分别检测感染细胞中的正链和负链RNA,结果均扩增出目的基因,提示病毒突变体基因组在细胞中进行了复制。使用间接免疫荧光检测RHDV的蛋白情况,结果表明在感染细胞中存在较多的特异荧光,证明在细胞中存在病毒蛋白的表达。此外,还用实时定量PCR方法对RHDV突变体基因组的复制情况进行了检测,结果显示用突变体(PBLRHDVd5325-6931)RNA转染细胞后,第6h可以检测到病毒基因组的复制,基因组拷贝数为4.66×108基因拷贝/mL,在第24h,基因组的拷贝数达到峰值(1.11×109基因拷贝/mL)。类似地,PBLRHDV-dVp60突变体接种细胞后,第6h也可以检测到病毒基因组的复制,基因组拷贝数为6.23×10~8基因拷贝/mL,在第24h,病毒基因组的拷贝数达到峰值(8.81×10~8基因拷贝/mL)。随后2个突变体病毒基因组的拷贝数都逐渐降低,证明病毒缺失突变以后在细胞中可以正常复制,但是两个突变体之间的复制水品平稍差别,相对pBLRHDV-d(5325-6931)而言,PBL-RHDV-dVp60的复制水平要低一些,但是相对完整RHDV而言,两个病毒突变体的复制水平都明显降低,提示本研究中VP60的缺失区域可能存在一些与病毒复制有关的一些序列或元件,当然这还需要进一步研究证实。