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目的1、建立一种牛肌腱高效提取胶原蛋白的方法并对提取的胶原蛋白的生物学性能进行表征检测。2、观察牛肌腱胶原蛋白和鼠尾胶原蛋白构建的组织工程皮肤收缩情况。3、研究不同类型胶原蛋白对角质形成细胞粘附的影响,并用原子力显微镜观察胶原与种子细胞粘附的微观结构。4、利用天狼猩红偏振光法检测复方壳多糖组织工程皮肤中胶原合成与分泌情况。方法1、建立了以酸酶联合提取牛肌腱胶原蛋白的方法,并对提取的牛肌腱胶原进行氨基酸含量、热变性温度、红外光谱及其它的一些生物学性能检测。2、新鲜清洁儿童包皮,用酶消化后分离培养角质形成细胞和成纤维细胞,用我科已建立的方法,分别采用牛肌腱胶原蛋白和鼠尾胶原蛋白构建复方壳多糖组织工程皮肤,观察不同类型胶原蛋白构建的组织工程皮肤的收缩情况,绘制收缩曲线。3、分别用牛肌腱胶原、鼠尾胶原和标准Ⅳ型胶原包被培养板,接种相同数量的原代角质细胞,在不同时相用活细胞电子计数仪测定未粘附细胞的数量,观察不同类型胶原所未粘附的细胞数量的多少,绘制细胞粘附曲线,并用原子力显微镜观察胶原蛋白与细胞的粘附情况。4、用我科已建立的方法,制备复方壳多糖组织工程皮肤,然后采用苦味酸-天狼星红染色,用偏振光显微镜观察, Photoshop半定量分析制备的复方壳多糖组织工程皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌情况。结果1、以牛肌腱为原料,用醋酸及水果蛋白酶的方法,可以高效率的提取胶原蛋白,经测定提取的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白。2、用牛肌腱胶原构建的组织工程皮肤其收缩度比相同浓度的鼠尾胶原构建的组织工程皮肤其收缩度小(P<0.05)。3、接种1小时以内,Ⅳ型胶原对角质形成细胞的粘附特性强于牛肌腱胶原和鼠尾胶原,1小时以后,三者粘附差别不明显,牛肌腱胶原和鼠尾胶原亦无明显差异。4、原子力显微镜可以清晰的观察到胶原及胶原与细胞间粘附的微观结构。5、正常皮肤和复方壳多糖组织工程皮肤的真皮中都有Ⅰ、Ⅲ胶原,在正常皮肤的真皮中Ⅰ、Ⅲ胶原含量分别是98.51±11.28、33.93±3.90;培养成熟的复方壳多糖组织工程皮肤中Ⅰ、Ⅲ胶原含量分别是91.42±3.82、30.75±2.29,两者相比无明显差异(P >0.05)。复方壳多糖组织工程皮肤培养8天、15天、30天,组织内Ⅰ型胶原分别为50.75±4.22、63.57±6.87、91.42±3.82 ,Ⅲ型胶原分别为16.90±1.64、23.65±4.08、30.75±2.29,组间比较有显著差异(P<0.01)。结论1、酸酶相结合的方法可以高效率的从牛肌腱中提取胶原蛋白,用提取的牛肌腱胶原构建的组织工程皮肤其收缩度比鼠尾胶原构建的组织工程皮肤收缩度小,说明用牛肌腱胶原蛋白能显著降低组织工程皮肤的收缩度,证明组织工程皮肤制造选择牛肌腱胶原较好,能够提高产品的性能。2、牛肌腱胶原和鼠尾胶原与Ⅳ型胶原对角质形成细胞的粘附作用无明显差别,用原子力显微镜可以观察到胶原及胶原与细胞间粘附的微观结构。3、培养成熟的组织工程皮肤与正常人皮肤中胶原含量及分布无明显差异。组织工程皮肤不同的培养时期胶原的含量及种类有明显差异。并且,利用天狼猩红-偏振光法可以观察到组织工程皮肤和正常皮肤中胶原的分布,Ⅰ型胶原呈现红色或橙黄色,Ⅲ型胶原为绿色。