论文部分内容阅读
动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)性心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是一种以大中动脉血管壁脂质堆积和慢性炎症反应为特点的疾病,泡沫细胞形成是As发生过程中的早期关键事件,但其形成的分子学机制目前仍没有完全阐明。近年研究发现许多miRNAs在高血压、动脉粥样硬化等心血管系统疾病的发生发展过程中起重要作用,课题组前期低密度芯片初筛结果显示冠心病患者血清中miR-320a表达异常,已有报道提示miR-320a可能参与调节As的发生发展,但其具体机制还有待探究。目的:(1)采用实时荧光定量PCR技术(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)进一步验证健康人群和As患者血清中miR-320a的表达情况;(2)在泡沫细胞模型中中明确miR-320a的表达变化及与其预测靶基因ABCG1之间的关系,miR-320a对细胞因子表达,胆固醇流出及细胞内脂质构成等在As发生发展过程中关键环节的影响;(3)采用高脂诱导的As小鼠模型,通过上调或降低miR-320a的表达来进一步验证其在As发展过程中的作用机制。方法:(1)收集92例动脉粥样硬化患者和100例健康对照者血清,用qRT-PCR方法检测miR-320a表达水平,对前期芯片结果进行验证。(2)采用生物信息学预测软件如miRanda、TargetScan、PicTar等数据库进行生物信息学分析,结合统计学分析方法预测miR-320a的下游靶基因并用荧光素酶报告基因系统验证其靶向关系。(3)采用ox-LDL刺激巨噬细胞构建泡沫细胞模型,采用qRT-PCR技术对泡沫细胞中miR-320a表达量进行检测。(4)采用脂质体瞬时转染、过表达质粒技术、小干扰RNA技术在泡沫细胞中实现miR-320a的过表达或抑制表达,采用Western Blotting技术检测其下游靶基因ABCG1表达变化情况。同时分别采用高效液相色谱法、酶法和ELISA方法检测泡沫细胞内脂质构成,胆固醇外流和炎症因子IL-6和TNF-α等的变化。(5)构建高脂诱导LDLr基因敲除的动脉粥样硬化(As)模型小鼠,并将慢病毒质粒(过表达或抑制表达)通过尾静脉注射入As模型小鼠,在小鼠体内实现miR-320a的过表达或抑制表达,检测其对于小鼠血脂和As斑块形成的影响。结果:(1)qRT-PCR结果显示,与健康对照组相比,As患者血清miR-320a表达量显著升高(p<0.001),与前期芯片结果一致;同时,泡沫细胞模型中miR-320a含量与对照组相比也显著增加(p<0.001)。(2)生物信息学软件分析结果显示ABCG1可能是miR-320a的可能的靶基因;荧光素酶报告基因系统分析证实,过表达miR-320a可以显著抑制含有ABCG1 3’-UTR的荧光素酶报告基因的荧光素酶活性(p<0.05),而抑制miR-320a的表达则可以增加荧光素酶活性(p<0.05)。当将ABCG1 3’-UTR与miR-320a结合的序列突变后,过表达和抑制表达miR-320a后均不能改变荧光素酶活性,证实miR-320a可以直接作用于ABCG1 3’-UTR。在泡沫细胞模型中过表达miR-320a后,ABCG1蛋白表达含量明显下降;而抑制miR-320a后,ABCG1表达水平则明显上升。证明miR-320a可以靶向抑制ABCG1的表达。(3)细胞功能研究显示,在泡沫细胞中过表达miR-320a可导致细胞因子IL-6和TNF-α分泌增加,胆固醇外流量减少,细胞内胆固醇酯含量增加;抑制表达miR-320a则出现相反现象,提示miR-320a可促进细胞内脂质堆积,加剧As发生发展。在泡沫细胞中直接抑制AJBCG1的表达,也使胆固醇外流量减少,细胞内胆固醇酯含量增加;而过表达ABCG1则会出现相反现象。(4)动物实验结果显示,通过尾静脉注射慢病毒可以实现在As小鼠模型中实现miR-320a的过表达和抑制,体内miR-320a表达含量增加可以提高血脂水平,促进As斑块的形成。结论:miR-320a水平升高可以负向调节下游靶基因ABCG1的表达,增加细胞内胆固醇的聚集和细胞因子分泌,参与As的发生发展;miR-320a可能是As发生、发展的重要调控因子,是动脉粥样硬化治疗的潜在新靶标。