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目的:
体外分离培养奶牛MaSCs,研究其生物学特性,并对其进行体外扩增和鉴定,开辟奶牛乳腺疾病治疗的新途径,为乳腺生物反应器的制备提供种子细胞。
方法:
本试验分为三个部分:试验一分离MaSCs,并进行原代和传代培养纯化,绘制其生长曲线和瑞氏-吉姆萨(RS-GMS)染色来研究其生物学习性,并对细胞进行冻存和复苏。试验二取6月龄和18月龄奶牛乳腺组织分离培养MaSCs,比较其生长特点及增殖能力。试验三对分离培养并传代纯化的MaSCs通过碱性磷酸酶(AKP)染色、染色体核型分析和αs1-酪蛋白基因和k-酪蛋白基因的PCR扩增来进行鉴定。
结果:
1.本试验应用贴壁筛选法成功分离得到奶牛MaSCs,体外培养到第12代,细胞数量扩增到5000倍以上。本试验分离得到的奶牛MaSCs具有干细胞的典型特征:外形呈多角形、长梭形或椭圆形,细胞核质比较大、胞浆中细胞器少、核仁明显。奶牛MaSCs具有快速增殖能力,细胞形态均一,排列有序,体外培养12代细胞活性仍无变化。
2.6月龄组牛MaSCs增殖能力、贴壁能力、培养形成的细胞集落数均高于18月龄组。
3.瑞氏-吉姆萨(RS-GMS)染色证明奶牛MaSCs各代之间形态较一致,绝大多数细胞为典型的成纤维样,细胞呈漩涡状排列,细胞形态以梭形为主,有少量小圆形细胞和大而扁的细胞。
4.碱性磷酸酶(AKP)染色细胞呈阳性,证明所得细胞为比较原始的细胞。
5.奶牛MaSCs核型分析表明该细胞具有正常核型,该细胞状态稳定,体外培养条件下没有发生恶化。
6.奶牛MaSCsαs1-酪蛋白扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测,得到一条长1736bp的片段,k-酪蛋白基因酪蛋白基因扩增出一条长度为780bp的目的条带,扩增片段特异性良好,无杂带出现,目的片段的大小与预期结果相吻合。
综上所述,本试验分离得到的奶牛MaSCs的确为比较原始的细胞,根据形态特征、增殖能力、及鉴定试验基本证明该细胞为奶牛MaSCs。