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代谢工程改造已成为提高微生物天然生产及异源合成各种高附加值产物产量与得率的常用技术手段。传统代谢工程技术多采用静态控制策略,主要为合成途径限速酶的过表达、竞争途径的敲除/低、ATP供应的优化控制、氧化还原反应的平衡及前体代谢的调控等,以此重新分配稳态通路的通量。但是,这种工程菌株往往不能对基因表达进行动态响应及调控,适应环境变化的鲁棒性低。动态控制策略可以使细胞持续感应培养体系的环境变化,重新平衡核心代谢途径的通量,调控生理状态及代谢特征。因此,动态控制可以更好地平衡菌株生长、代谢与目标产物合成,减少有毒中间体的积累,而且异源途径酶表达的动态控制可以有效地降低外源多酶共表达的代谢压力。近年来,启动子文库的高通量筛选及合成生物学技术的快速发展,为动态控制策略的实现提供了重要支持,但目前有关动态控制策略的报道多集中于原核细胞,酵母及高等真核细胞的工作则很少,这主要与真核细胞复杂的转录调控机制有关。丙二酰辅酶A(Mal-CoA)是聚酮、黄酮、脂肪酸等活性分子生物合成的重要前体,也是参与细胞生理反应的关键代谢分子。通常情况下,细胞内Mal-CoA浓度很低,提取定量后进行代谢调控存在诸多困难,在线检测技术尚未建立,限制了其下游化合物合成的反馈调节。若能使细胞根据Mal-CoA浓度变化自发进行动态调控,无疑会利于Mal-CoA在细胞内的稳定形成和高效转化。然而,目前有关真核细胞的Mal-CoA动态控制的报道却寥寥无几。毕赤酵母(Komagataella phaffii)是目前应用最广泛的基因工程真核表达系统之一,作为合成生物学底盘宿主也引起广泛关注和开发。该菌株已被美国FDA认定为安全菌株(Generally recognized as safe,GRAS),可用于医药及食品领域。本课题以该菌株为对象,设计了一种Mal-CoA生物传感器,研究了 Mal-CoA生物传感器在代谢动态控制方面的应用。首先,在毕赤酵母中设计了两个调控模式相反的Mal-CoA生物传感器,构建以Mal-CoA浓度感应为核心的动态调控体系。将毕赤酵母PAOX1启动子的转录激活因子Prm1与枯草芽孢杆菌转录阻遏因子FapR融合表达,形成了一个依据DNA结合位点不同而兼具产生激活和阻遏功能的融合转录因子。将可特异性结合FapR的枯草芽孢杆菌操纵基因元件fapO按不同位点插入毕赤酵母强组成型启动子PGAP,构建了 24个PGAP-fapO系列杂合启动子,获得了 24个Prm1-FapR/PGAP-fapO人工转录调控器件。基于枯草芽孢杆菌天然系统中Mal-CoA与FapR的结合特性,毕赤酵母中Mal-CoA、PGAP fap(O与Prm1-FapR竞争性结合,实现Mal-CoA浓度对该系列人工转录调控器件的调控功能。经过检验24个器件,获得了具有较为严谨的阻遏/去阻遏调节模式的Mal-CoA生物传感器Prm1-FapR/PGAP-(+22)fapO,其输出信号强度随着Mal-CoA浓度提高而增强。然后,移除毕赤酵母强诱导型启动子PAOX1的所有上游调控序列,仅保留核心启动子序列cPAOX1,将fapO按间隔距离(碱基数)不同连接于cPAOX1启动子5’上游区域,构建了18个fapO-cPAOX1系列杂合启动子,获得了 18个Prm1-FapR/fapO-cPAOX1人工转录调控器件。同理,基于Mal-CoA、PGAP-fapO与Prm1-FapR竞争性结合,可实现Mal-CoA浓度对该系列人工转录调控器件的调控功能。经过检验发现,18个器件获得了具有较为严谨的激活/去激活调节模式的Mal-CoA生物传感器Prm1-FapR/(-52)fapO-cPAOX1,输出信号强度随着Mal-CoA浓度提高而降低。将两个传感器 Prm1-FapR/PGAP-(+22)fapO与 Prm1-FapR/(-52)fapO-cPAOX1整合到单个毕赤酵母菌株中,用以检验两者发挥调控功能的协同性以及调控范围的适配性。将Prm 1-FapR/PGAP-(+22)fapO与 Prm 1-FapR/(-52)fapO-cPAOX1分别用于表达报告蛋白 GFP和mCherry,通过添加浅蓝菌素改变胞内Mal-CoA浓度以检验调控效果,表明两个传感器展现了良好的调控功能协同性及适配性。基于此,以Prm1-FapR/PGAP-(+22)fapO控制细胞内Mal-CoA的消耗通路(6-甲基水杨酸合成途径),以Prm1-FapR/(-52)fapO-cPAOX1控制细胞内Mal-CoA的来源通路(Mal-CoA合成途径),实现了细胞内Mal-CoA在固定浓度范围内的周期性振荡变化。这对于真核细胞Mal-CoA衍生产物的代谢控制及合成优化提供了新的思路。基于上述人工转录调控器件及生物传感系统,开发了一种动态调控酵母生物合成系统,以动态控制Mal-CoA代谢流优先用于目标Mal-CoA衍生聚酮产物的合成。在异源底盘宿主中合成Mal-CoA衍生产物,常因为脂肪酸合成途径的竞争而导致目标产物合成能力受限。脂肪酸对细胞生长及活性维持不可缺少,因此常给代谢控制带来难题。若能在细胞持续性合成聚酮化合物6-MSA等目标产物时,脂肪酸合成能够响应高Mal-CoA浓度(富足)呈现开启状态,响应低Mal-CoA浓度(有限)呈现关闭状态,则既能满足为基础代谢提供脂肪酸,又能使Mal-CoA优先用于6-MSA合成而提升产物合成效率。在检验Prm1-FapR/fapO-cPAOX1系列人工转录调控器件过程中发现,尽管Prm1-FapR可激活fapO-cPAOX1杂合启动子,但Prm1-FapR/(-7)fapO-cPAOX1的表达模式却不受细胞内Mal-CoA浓度调控,即仅具备激活功能却不具备去激活功能,因此该类型器件可用于控制6-MSA持续合成。将Prm1-FapR表达所用启动子由组成型PPRM1更换为乙醇诱导型PICL1以适应高产乙醇培养基,并以PICL1增强Prm1-FapR的表达来强化调控功能。与前述类似,再次检验了fapO在PGAP中的9个插入位点,证明Mal-CoA生物传感器Prm1-FapR/PGAP-(+2)fapO显示最低的绿色荧光蛋白表达能力(PGAP-fapO启动子活性),展现了良好的Mal-CoA低水平阻遏和高水平去阻遏的调控模式,可用来控制脂肪酸合成通路。将两种器件整合至同一菌株并检验产物合成情况,在菌体生长未受影响的情况下,6-MSA产量增加了 110%。这证明了动态控制使Mal-CoA重定向,有利于目标产物的合成。该方法为酵母及其他真核底盘宿主合成Mal-CoA衍生化合物提供了新的参考。