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阿魏酸酯酶和木聚糖酶是两种极其重要的半纤维素降解酶,它们可以作为绿色生物催化剂应用于饲料、能源、食品和医药等多种工业领域。目前已商品化的酶多数为中温酶,然而,在工业应用中常常会遇到或需要高温环境,大大限制了它们的应用范围,因此中温酶的热稳定性改造具有重要意义。本论文以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001来源的阿魏酸酯酶A(AuFaeA)为对象,研究了天然二硫键对其酶学性质的影响,并通过理性设计添加二硫键和迭代饱和突变对该酶进行了热稳定性改造。从米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC40186中克隆了一种新型GH 10家族木聚糖酶AoXyn10B的全长cDNA和完整DNA序列,将其基因Aoxyn10B在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达。此外,实现了AoXyn10B和一种热稳定性改造后的阿魏酸酯酶Au FaeAA126C-N152C在毕赤酵母中的共表达,并对两者的协同作用进行了初步研究。主要研究结果如下:(1)将AuFaeA中三个天然二硫键分别去除,构建了三个突变酶AuFaeAC29T、AuFaeAC91T和AuFaeAC234T,将其与原酶分别在毕赤酵母中表达;重组阿魏酸酯酶reAuFaeA、reAuFaeAC29T、reAuFaeAC91T和reAuFaeAC234T的比酶活力分别为50.2、10.53、5.37和6.12 U·mg-1;re AuFaeA的最适温度为45℃,在50、55和60℃的半衰期分别为50、15和8 min;reAuFaeAC29T、reAuFaeAC91T和reAuFaeAC234T的最适温度分别较原酶降低了20、20和10℃,并且热稳定性也大大下降,在其各自最适温度下的半衰期仅为10、7和9 min;该三个突变酶对于底物pNPF的催化效率(kcat/Km)分别为283、143和153 mmol·L-1 min-1,较原酶(2235 mmol·L-1 min-1)下降显著。以上结果表明天然二硫键对AuFaeA的功能影响较大。(2)基于MODIP和DbD软件的预测,向AuFaeA中引入一个新的二硫键C126-C152,将突变酶AuFaeAA126C-N152C的基因在毕赤酵母GS115中表达,获得重组阿魏酸酯酶reAuFaeAA126C-N152C,其比酶活力为59.7 U·mg-1,较reAuFaeA略有提高;reAuFaeAA126C-N152C的最适温度为51℃,较reAuFaeA提高了6℃;其在55和60℃下的半衰期分别为188和40 min,是reAuFaeA的12.5和5倍;reAuFaeAA126C-N152C的kcat/Km与reAuFaeA相差不大。(3)基于B-factor值、ΔΔG值及结构分析,确定了AuFaeA中4个拟突变氨基酸位点Ser33、Asn92、Glu203和Asp245进行迭代饱和突变;利用毕赤酵母表达系统分别构建饱和突变库,经筛选,针对各位点分别筛得6、9、2和8个耐热突变子;在Ser33的耐热突变子中,S33E为最优突变子,其最适温度为49℃,在50和55℃下的半衰期分别为82和18 min,Tm值为41.7℃;Asn92的耐热突变子中,S33E/N92R为最优突变子,其最适温度为51℃,在50和55℃下的半衰期分别为198和35 min,Tm值为44.5℃;Glu203的耐热突变子中,S33E/N92R/E203T为最优突变子,其在55℃下的半衰期为25min;Asp245的耐热突变子中,S33E/N92R/D245E为最优突变子,其最适温度为49℃,在50和55℃的半衰期分别为90和31 min;各氨基酸位点的迭代突变虽然没有达到预期的热稳定性叠加效果,但是最优突变子S33E/N92R的热稳定性较原酶AuFaeA已有明显提高。(4)从米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC40186总RNA和基因组DNA中克隆得到基因Aoxyn10B的全长cDNA和完整DNA序列,序列长度分别达1689 bp(除polyA)和2308 bp;AoXyn10B的氨基酸序列含有21个氨基酸的信号肽、317个氨基酸的催化域(CD)、38个氨基酸的碳水化合物结合结构域(CBM1)以及CD与CBM1之间97个氨基酸的连接肽;模拟的AoXyn10B三维结构主要呈现为(β/α)8桶状,两个保守的催化氨基酸(Glu131和Glu238)位于一个疏水裂缝中;将Aoxyn10B在毕赤酵母GS115中表达,获得重组木聚糖酶(AoXyn10B)的比酶活力为577 U·mg-1;该酶最适pH为5.5,在pH4.0~7.0之间性质较稳定;最适温度为60℃,在50℃及其以下性质稳定;其Km和Vmax值分别为1.7 mg·mL-1和817μmol·min-1·mg-1;除Mn2+和Ba2+对重组AoXyn10B有一定的抑制作用,所测大多数金属离子和EDTA对该酶活力影响不明显。(5)将AuFaeAA126C-N152C和AoXyn10B在毕赤酵母中共表达,产物经初步分离纯化、冷冻干燥后,AuFaeAA126C-N152C和AoXyn10B的酶活力分别为11.59和46.4 U·mg-1;二者对去淀粉麦麸的最适协同作用温度为50℃,在该温度下,双酶协同释放的阿魏酸量是AuFaeAA126C-N152C单独释放阿魏酸量的8.06倍,而AuFaeA和AoXyn10B的最适协同作用温度为45℃,在该温度下,双酶协同释放的阿魏酸量是AuFaeA单独释放阿魏酸量的8.64倍;AuFaeAA126C-N152C与AoXyn10B在50℃下协同作用9 h达到最大的阿魏酸释放量1.35 mg,而AuFaeA与AoXyn10B在45℃下协同作用10 h达到最大的阿魏酸释放量1.20 mg,前者的阿魏酸释放量是后者的1.12倍;说明热稳定性越好的阿魏酸酯酶,其与木聚糖酶的协同作用效果越好,具有的应用前景越好。