论文部分内容阅读
马铃薯晚疫病（Potato Late Blight）由致病疫霉菌P.infestans引起,该病害在适宜的环境条件下能快速发展造成病害流行,是一种毁灭性的卵菌病害。生产上,防控马铃薯晚疫病最有效的手段是种植抗病品种,但是由于该病病原菌P.infestans不断发生毒性变异,经常导致作物品种抗性的丧失,病害呈周期性流行和爆发。在晚疫病菌侵染寄主的过程中,该病原菌与寄主发生互作,植物体产生免疫反应,这包括复杂的交叉-结合的信号传输网和信号调节过程。植物诱导防御的第一个阶段包括对保守微生物分子的认知（病原菌相关分子模式;PAMPs）,或者由于细胞的损伤而产生的分子（DAMPs）的识别,导致防御通道的激活,这一过程被称为跨膜识别受体触发的防卫反应（PTI）。寄主的特异性病原物则逐步地操纵和抑制PTI,来提高植物感病性。效应蛋白（Effector）,是植物病原微生物在与寄主植物互作过程中分泌的、可被植物NBS-LRR抗性蛋白特异识别、兼具毒性与无毒性功能的蛋白,是病原物用于抑制PTI的策略之一。因此,鉴定效应蛋白及与它们互作的寄主靶蛋白,以及研究效应蛋白操纵寄主使植物感病机制是当前研究的一个重点。本论文以致病疫霉菌（Phytophthora infestans）分泌的定位在细胞核上的重要效应蛋白PexRD41为研究对象,该效应蛋白的基因地址是04089,因此本研究通称PITG04089（Pi04089）,获得的研究结果如下:（1）通过在Pi04089基因序列的N端融合绿色荧光蛋白GFP,介导农杆菌后转染模式植物本氏烟,接种马铃薯晚疫病菌,与对照GFP空载体相比,显著促进了马铃薯晚疫病的侵染。借助共聚焦荧光显微镜Confocal进行活体观察,确定了PITG04089蛋白显著地定位于细胞核,在细胞核核仁周围形成一个环。被测RxLR效应蛋白PITG04089（Pi04089）基因表达量在晚疫病菌侵染的早期阶段（24h和48h）出现显著的基因上调,这种上调作用甚至可以持续到72h。（2）为了验证核仁在Pi04089行使功能中的作用,本研究在GFP-040894 N端加入出核信号NES,形成NESGFP-Pi04089融合蛋白,经confocal观察,GFP绿色荧光蛋白在细胞核仁中显著减少,同时细胞质中的绿色荧光显著增强,说明该信号将GFP-Pi04089极大地运出细胞核。在本氏烟上进行ATTA实验,瞬时表达GFP-Pi04089和NESGFP-Pi04089后接种晚疫病菌,病斑测量值进行方差实验,结果显示与GFP-Pi04089相比,修饰后的NESGFP-Pi04089显著地降低了晚疫病菌的侵染水平,大大削弱了效应蛋白Pi04089对晚疫病的侵染,表明细胞核是Pi04089在植物体内实现功能的重要部位。（3）为了筛选Pi04089在植物体内的互作靶蛋白,实验室构建了马铃薯晚疫病菌酵母双杂交库,cDNA文库材料来自于P.infestans侵染15h和72h的马铃薯植株病组织,从酵母双杂交系统中筛选到Pi04089在寄主中的靶蛋白为含3个KH结构域的RNA结合蛋白KRBP1（命名为StKRBP1）。此外,通过免疫共沉淀（Co-IP）技术,也验证了StKRBP1与Pi04089在植物体内的互作关系。（4）通过双分子荧光互补（BiFC）技术,发现Pi04089与KRBP1互作发生在细胞核内,免疫印迹western blotting实验证实了这些蛋白组合在植物中稳定存在。当Pi04089与KRBP1在本氏烟共表达（co-expression）时,Pi04089原先在细胞核核仁的环消失,定位因KRBP1的存在而改变,该效应蛋白定位到与KRBP1相同的细胞核核斑点上。在两者共表达植株上接种晚疫病菌,发现在病原菌早期侵染阶段（24h）,KRBP1蛋白表达量显著提高,因此证明了KRBP1对晚疫病菌侵染起正调节的作用。（5）利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术,将KHRBPs的保守基序GxxG突变为GDDG,构建了2个VIGS突变体StKRBP1mut。通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术,证明该突变体与Pi04089在酵母和植物体内不再互作。突变体阻止了Pi04089在核斑点上的定位,StKRBP1mut蛋白表达量也没有增加。（6）突变体StKRBP1mut不再帮助晚疫病菌提高对叶片的侵染,这表明核苷酸结合位点对效应蛋白Pi04089与KRBP1互作是必要的。研究结果显示KRBP1是一个感病因子（Susceptibility Factor）,效应蛋白Pi04089可能修饰或增强了KRBP1的活性,与KRBP协作提高病原菌侵染。