乌骨鸡（Gallus gallus domesticus Brisson）是江西地方特色食品资源和地道药材之一,有悠久的滋补和药用历史,乌骨鸡的特殊性就在其富含黑色素,黑色素是其重要的功能成分。矿物质元素会直接或是间接地对黑色素生物合成过程产生影响,Ca、Fe元素在乌骨鸡黑色素中的含量显著高于其他矿物元素,可能是乌骨鸡黑色素生物合成中参与程度最高的矿物元素。本研究在获得能大量体外培养且稳定传代的乌骨鸡黑色素细胞的基础上,研究Ca、Fe元素对乌骨鸡黑色素细胞生长和黑色素生物合成的干预作用,为进一步提高和改善乌骨鸡中黑色素的合成量、结构组成和功能活性提供科学基础,为促进江西乌骨鸡资源开发和产业发展作出贡献。主要研究结论归纳如下:1,采用MTT法研究葡萄糖、卵黄总脂质等生长因子对黑色素细胞增殖作用,可知葡萄糖浓度是乌骨鸡黑色素细胞生长的必要条件,又是黑色素合成的主要影响因素。在高糖（25mMGlc）培养条件下,5%FBS、1%卵黄总脂质有显著促进细胞生长作用,作用强度且无显著差别,且两者联用有协同作用;TPA和卵黄总脂质的生长曲线说明,卵黄总脂质较TPA更有利于乌骨鸡黑色素细胞的生长;低浓度葡萄糖（16.8 mM）培养条件下FBS是促进细胞生长的主要因素。2,研究了钙铁元素对体外培养低黑色素起点的乌骨鸡黑色素细胞生长的影响发现,低浓度（0.01-0.02mmol/L）Fe³⁺和Fe²⁺对黑色素细胞的生长有显著促进作用。在0.04 mmol/L Fe³⁺背景下,0.04-0.16 mmol/L Fe²⁺对乌骨鸡黑色素细胞的生长有抑制作用。不同价态的铁元素对乌骨鸡黑色素细胞的生长的作用是不同的,二价铁的细胞毒性显著高于三价铁。Ca²⁺在0.1-6.4 mmol/L浓度区间内会极显著的促进黑色素细胞的生长,1.6 mmol/L时促进作用最强。可知乌骨鸡黑色素细胞对Ca²⁺的耐受力远大于Fe³⁺和Fe²⁺,这可能和细胞内的黑色素含量有关。3,采用细胞划痕实验研究Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺+Fe³⁺对乌骨鸡黑色素细胞迁移能力的影响。0.4mmol/L CaCl₂能显著促进黑色素细胞迁移。使用钙离子拮抗剂维拉帕米阻断了L-型钙通道后,细胞外钙内流受阻,钙对黑色素细胞的迁移能力的促进作用显著下降,说明L-型钙通道是钙离子进入黑色素细胞的重要通道。FeCl₃（0.04⁰.16 mmol/L）对细胞迁移率具有明显促进作用,随FeCl₃的浓度增大而增大,并呈铁剂量依赖。0.01 mmol/L FeSO₄对细胞迁移率具有明显促进作用,继续增大浓度,则对细胞迁移没有促进作用。0.04 mmol/L FeCl₃和（0.01⁰.08）mmol/LFeSO₄联用时即Fe³⁺:Fe²⁺=4:1、2:1、1:1、1:2,对细胞相对迁移率具有促进作用,并随着Fe²⁺浓度增大,促进作用减弱,可见两者联合并未有良好的协同作用。肌肽通过螯合Fe³⁺和Fe²⁺离子,或是将Fe³⁺还原为Fe²⁺离子发挥抑制作用,进而进一步验证了Fe³⁺和Fe²⁺离子对黑色素细胞的迁移的促进作用。明胶酶谱法检测乌骨鸡黑色素细胞上清液和全蛋白的基质金属蛋白酶的酶活,发现在同等培养条件下,阳性对照组有蓝色背景下的白色条带（MMPs的活性条带）,而黑色素细胞未见白色条带。说明在此培养条件下,乌骨鸡黑色素细胞不表达基质金属蛋白酶。4,溶剂A溶解精制黑色素得到黑色素标准品,分析比较精制黑色素和标准品黑色素的红外光谱图发现二者无明显差异,但各特征峰的吸收强度和宽度不同,标品黑色素烷烃结构吸收峰更强。可推断标品有酰胺结构和游离的羟基而精制黑色素有伯酰胺结构。5,发现了另一种独特的可以溶解乌骨鸡黑色素标品的溶剂B,在溶剂A中,黑色素标准品的最大溶解度为60ug/mL（25℃）,且溶剂在405nm处吸光度背景大。在溶剂B中,黑色素标品的最大溶解度为250ug/mL（25℃）,在405nm处溶剂吸光度背景小。溶剂B的细胞中黑色素含量的可见光分光光度法测定的方法学考察表明:乌骨鸡黑色素标品溶液在5²50ug/mL范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系,相关系数r=0.9995（n=9）。精密度实验,黑色素吸光度值的RSD为1.3%—2.0%;细胞样品在3h内稳定RSD为4.86%;试验重复性良好,RSD为4.4%。黑色素细胞样品平均加标回收率在95.2%¹03.6%之间,RSD为3.5%。6,酶学方法研究酪氨酸二钠、酪氨酸、葡萄糖、钙离子、不同价态的铁离子以及钙铁组合对乌骨鸡黑色素细胞黑色素生物合成关键酶酪氨酸酶活性的影响发现,酪氨酸二钠是增强乌骨鸡黑色素细胞黑色素生物合成关键酶酪氨酸酶活性的重要因子,适当的葡萄糖浓度会产生协同作用。高浓度的Ca²⁺（0.4-1.6mM）,低浓度的Fe²⁺（0.01mM）和Fe³⁺（0.01-0.04mM）对酪氨酸酶激活均有显著的促进作用。Ca²⁺、Fe³⁺和Fe²⁺均对黑色素细胞酪氨酸酶激活率有显著的促进作用,但联用后会降低各自的促进作用,而Fe³⁺和Fe²⁺联用时则对酪氨酸酶活无促进作用。7,荧光酶标仪定量检测钙铁元素对黑色素细胞内的ROS含量的影响,发现Ca²⁺（0.2-0.8mM）会显著提高黑色素细胞ROS含量,其中0.4mM促进作用最强。Fe²⁺和低浓度的Fe³⁺会降低黑色素细胞内ROS含量,且在此浓度下的钙离子和铁离子对黑色素细胞生长没有抑制作用,说明在钙铁的干预下,虽然黑色素细胞的ROS含量发生变化,但细胞内的ROS平衡并未失衡。8,新建立的黑色素含量测定方法考查卵黄总脂质、TPA、钙、铁元素对黑色素合成量的影响,结果表明,卵黄总脂质对低黑色素起点的乌骨鸡黑色素细胞合成黑色素有明显的促进作用;TPA会抑制其促进作用。钙、铁元素对乌骨鸡黑色素细胞生物合成黑色素有明显促进作用,钙元素强于铁元素,且两者无协同作用,而该浓度下的二价和三价铁离子具有协同作用。钙、铁元素干预后,生物合成所获得的黑色素抗氧化能力显著增强了,以三价铁干预产生的黑色素抗氧化能力最强。9,Western bolt方法检测钙铁元素对酪氨酸相关蛋白酶1（TRP1）表达的影响,结果显示,Ca²⁺能显著促进黑色素细胞TRP1的表达,而Fe²⁺和Fe³⁺会显著抑制黑色素细胞TRP1的表达,而Fe²⁺和Fe³⁺联用时又会促进黑色素细胞TRP1的表达,Fe²⁺和Fe³⁺分别和Ca²⁺联用时,会显著抑制Ca²⁺对TRP1表达的促进作用,其中二价铁的抑制作用强于三价铁。10,采用钙离子拮抗剂维拉帕米阻断黑色素细胞钙离子通道后,细胞内钙离子含量减少,细胞黑色素含量显著降低,TRP1酶表达量减少,而黑色素含量依然显著高于对照组,因而说明黑色素细胞主要通过L-型钙离子通道摄取钙离子,影响黑色素合成和酪氨酸相关蛋白酶1的表达的,但也有其他摄入方式进入细胞参与黑色素合成。11,采用MTT法研究葡萄糖、过氧化氢、卵黄总脂质、牛磺酸和柠檬酸锌对HUVEC-12细胞存活的影响。结果表明,高糖在72h内对细胞存活影响不大,48h除外;无糖在12-72h会显著抑制细胞存活,呈时间依赖性;1mM H₂O₂会显著抑制细胞存活,且呈时间依赖性;12h内,卵黄总脂质对细胞存活率无抑制作用。24h内,牛磺酸对细胞存活率无抑制作用。12h内,柠檬酸锌对细胞存活率无抑制作用。12,采用MTT法研究卵黄总脂质、牛磺酸和柠檬酸锌对HUVEC-12细胞的H₂O₂和无糖损伤保护作用的影响。结果表明,低浓度卵黄总脂质、作用浓度的牛磺酸和柠檬酸锌对H₂O₂损伤内皮细胞的有保护作用。三者两两联合对H₂O₂损伤内皮细胞的保护作用弱于三者单独。然而,作用浓度的柠檬酸锌、牛磺酸和卵黄总脂质对无糖引起的内皮细胞的损伤没有保护作用。