HBV DNA聚合酶及SARS-CoV S蛋白的表达研究

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乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝性病毒(hepadnavirus)家族,它的基因组是约为3.2kb的部分双链的环状DNA,包含四个开放阅读框(ORF),分别编码表面蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)、X四类蛋白.多聚酶P蛋白分子量约为90kDa,包含有末端蛋白(terminal protein、TP),间隔区(Spacer),逆转录酶/DNA聚合酶(Reverse Transcriptase/DNA Polymerase,RT)及核糖核酸酶H(RNaseH)四个结构域.由于HBV DNA聚合酶在结构上可能有别于一般已知的逆转录酶,有独特的功能结构特征,因此,表达HBV DNA聚合酶及各个区段,对它们的结构和功能活性进行研究,将为研制新型特异的抗病毒药物奠定基础.本论文以含有HBV adr1亚型全基因组cDNA的质粒pBS_HBV3.6II为摸板扩增出所需的各片段,然后将构建N端带有Flag标记,C端带有包装信号ε的聚合酶全长基因克隆到pFastBacI中并利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统进行表达,用以研究药物突变对乙型肝炎病毒复制和耐药性的影响.同时分别利用不同的表达载体对TP和RT区段在大肠杆菌中进行了表达研究.着重对重组质粒p6Hi s-TP在大肠杆菌BL21中进行表达,6His-TP主要以包涵体的形式存在于菌体中.经破菌、离心洗涤,变性后再用Ni-NTA柱纯化,可以得到高纯度的目的蛋白,并摸索了复性条件.本论文还对SARS病毒(SARS-CoV)的表面刺突蛋白(Spike protein)进行了表达研究.S蛋白是SARS病毒颗粒表面的糖蛋白,作为病毒入侵宿主细胞的媒介,能够结合宿主细胞表面的病毒受体.因此,S蛋白是研制SARS疫苗的主要靶蛋白.成功表达SARS-CoV关键蛋白,对SARS病毒蛋白结构与功能进行研究,是阐明SARS感染人体的机理、建立分子水平的筛选模型以及开展抗SARS药物筛选的必由途径.此研究内容以本实验室RT-PCR获得的全长S基因(3765bp,BJ01)为模板扩增获得6段长短各异的片段,然后克隆到pET-28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21中进行表达,对变性纯化的S4片段用SARS康复病人血清检测.检测结果表明S4蛋白呈现很好的抗原抗体反应特性,因此,S4蛋白对以后SARS的检测及治疗均有一定的指导意义.
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