研究背景：随着世界人口的连续增长和人口老龄化的加重,肥胖症及骨质疏松症被认为两大严重危害人类健康的世界性公共卫生问题。机体进行性肥胖的特点是脂肪组织质量的增长,来源于脂肪细胞肥大及脂肪细胞的数目增加；在骨质疏松发展过程中,骨量减少往往伴行骨髓中的脂肪组织增多,以致骨髓组织逐渐被脂肪组织所替代。体外实验表明脂肪细胞和成骨细胞的来源相同,有共同的祖细胞——骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。MSCs是干细胞家族的重要成员之一,具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞,特定的环境下,可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等。多数学者[5-6]认为,若要诱导MSCs向某一种组织分化,则必须同时抑制其向其他的组织分化。机械应力存在于一切细胞微环境中,对于应力的促MSCs向成骨分化的作用,已有较多的报道,MSCs受力后,增殖能力以及成骨分化能力明显增强。在骨髓间充质干细胞的分化调控研究中,成骨分化和成脂肪分化往往需要被同时研究,这是由于骨髓间充质干细胞的这两种分化往往是对立的。由此可见,应力是调节机体功能的重要因素,骨小梁体积减少及骨量丢失与MSCs向脂肪细胞分化增加而向成骨细胞前体细胞分化减少有关。MSCs受到外界成脂分化信号刺激后,会激活一系列关键转录因子的表达,而这些转录因子继而转录出大量脂肪细胞特异的基因来执行特化的功能,最终完成MSCs向成熟脂肪细胞的转变。机体功能锻炼,如通过体操、按摩和全身振动是减少或防止肥胖,并改善骨质疏松的最佳方法。目的本实验目的在于通过观察MSCs在周期性牵张应力刺激以及在促成脂分化培养环境下,与成脂及成骨分化表达相关的基因水平变化,以了解周期性牵张应力对MSCs成脂及成骨分化的影响。由于普通培养培养环境下MSCs成脂分化较弱,标志物表达不明显,故使用促成脂分化培养环境以诱导MSCs分化,并加以应力干预。分离培养SD大鼠MSCs原代,传代纯化,并进行表面标志物CD29、CD34、CD44和CD45的检测,进行MSCs的鉴定。利用Flexcell5000XT细胞应力加载系统(Flexcell公司,美国),对MSCs加载低强度周期性机械牵张应力,并以不同的培养环境和不同的持续时间处理,实验结束后检测成骨相关基因(Runx-2、OSX)及成脂相关指标(脂滴、PPARγ、脂联素及C/EBPα)表达程度,观察并探讨周期性牵张应力刺激对SD大鼠MSCs成骨及成脂分化的影响。方法第一部分原代MSCs培养、鉴定及以化学诱导方式验证MSCs成脂分化之潜能：1、原代MSCs培养及鉴定选取4-5周龄,体质量为80-100g的SD大鼠(6只),雌雄不限。取其下肢长骨骨髓腔细胞进行全骨髓培养。2-3日换液一次,期间将不贴壁细胞去除,7-10日后原代细胞铺满瓶底,0.25%的胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液传代,培养SD大鼠骨髓细胞至第3代来得到纯化的MSCs,采用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD45,以鉴定MSCs。2、MSCs化学诱导成脂分化并油红O染色取第3代MSCs更换含10%胎牛血清、0.1μM的地塞米松(dexamethasone, DXM)、5μg/ml的胰岛素(insulin)、50gM的吲哚美辛(Indomethacin)以及0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(1-Methyl-3-isobutylxanthine, IBMX)的DMEM高糖培养基以行化学诱导成脂分化,换液频率同前,5日后与一组普通培养的MSCs行油红O染色,观察结果。第二部分周期性牵张应力对MSCs成骨分化的影响：1、实验设计分组及具体干预参数选用第3代MSCs,根据有无应力加载、应力加载时间持续天数、培养环境3个干预因素,将实验分为8组。应力干预借助Flexcell5000XT细胞应力加载系统(Flexcell公司,美国)实现,具体参数为5%幅度、正弦波型、10次/分钟、6小时/天,持续3天或5天。培养环境分为普通培养环境和促成脂培养环境,普通培养环境为含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基,而促成脂分化培养环境为含10%胎牛血清、0.1μM的地塞米松、5μg/ml的胰岛素、50μM的吲哚美辛以及0.5mM的IBMX的DMEM高糖培养基。并根据有无应力加载,将8组分为实验组和对照组。将第3代MSCs接种到Bioflex硅胶六孔板上,48小时后为促成脂分化诱导组MSCs更换促成脂分化诱导培养基然后进行干预。2、干预结束收集标本,行用荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)法及蛋白印迹法(Western Blot)检测MSCs成骨指标：Runt目关转录因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)及成骨细胞特异性转录因子(Osterix, OSX)的表达程度,观察应力对MSCs成骨分化的影响。实验所得数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对实验数据进行比较,统计学分析软件采用SPSS13.0。第三部分周期性牵张应力对MSCs成脂分化的影响：实验具体分组及干预参数同第二部分,选用第3代MSCs作为实验对象,接种到Bioflex硅胶六孔板上,48小时后为促成脂分化诱导组MSCs更换促成脂分化诱导培养基,利用Flexcell-5000X T牵张应力系统为实验组MSCs加载力学信号,按照各组的干预持续天数进行干预。干预结束后,收集标本并用显微镜观察MSCs形态,每个分组留一孔作油红O染色,并用Q-PCR法及Western Blot检测MSCs成脂肪分化指标：过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)、脂联素、CAAT增强子结合蛋白a(C/EBPa)的表达水平。实验所得数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对实验数据进行比较,统计学分析软件采用SPSS13.0.结果1、原代MSCs培养情况及流式细胞术检测结果：原代接种后镜下观察显示原代MSCs生长良好,形态成细长的梭形,细胞间隙窄,相互紧贴,呈旋涡状排布。7-10天后可铺满培养瓶底,传至第3代细胞生长良好,形态正常,其杂质大大减少,绝大部分为长梭状间充质细胞。送流式细胞检测,结果显示第3代MSCs的CD2、CD34、CD44、CD45的表型阳性率分别为93.6%、5.3%、91.4%和4.6%。MSCs化学诱导成脂分化油红O染色：MSCs化学诱导成脂分化5日后与普通培养环境下的MSCs共同行油红O染色,镜下可见视野中部分MSCs变大,形态由长梭形变得钝圆,胞质内出现了众多被染成橘红色的脂滴小颗粒,而普通培养环境下的MSCs形态仍维持长梭形,未见胞质内产生脂滴。2、牵张应力对MSCs成骨分化的影响：qRT-PCR结果显示：对照组中受到成脂化学诱导的MSCs,成骨相关的基因表达明显下降,而经过应力加载刺激的实验组与未经应力加载的对照组相比,其对成骨相关基因的表达明显上升。westernblot显示：在成脂化学诱导的培养环境下,经过应力加载刺激的实验组与未经应力加载的对照组相比,成骨相关指标表达明显上升。3、牵张应力对MSCs成脂分化的影响：油红O染色结果显示应力干预结束后将各组MSCs行油红O染色,可见对照组促成脂诱导组中的MSCs大小变大,形态变得稍钝圆,胞质内出现被染作橘红色的脂滴颗粒,而普通培养组并无明显胞质内出现脂滴的MSCs；实验组中MSCs由于受到应力干预刺激,细胞形态及排布均发生了一定的变化：贴壁MSCs形态梭形稍变长,轮廓鲜明,细胞出现沿受力环切线方向规则排列,在普通培养组的MSCs中未见有明显的脂滴生成,而促成脂分化培养环境中的MSCs亦未见有明显脂滴出现。qQT-PCR法检测MSCs对PPARγ2、脂联素及C/EBPα基因的表达：发现与普通培养环境相比,在成脂诱导培养环境中的MSCs中PPARγ2、脂联素和C/EBPα的mRNA表达均明显增高,加载了应力以后,促成脂培养环境中的MSCs对PPARγ2、脂联素和C/EBPα基因的表达明显下降,MSCs向成脂肪细胞分化的能力受到明显抑制。结论MSCs具有成脂分化的潜能,在促成脂分化培养环境中能分化成前脂肪细胞,而在化学诱导促成脂分化的过程中,对其加载低强度周期性的牵张应力,可以显著增加MSCs对Runx2及OSX的表达,显著降低其对PPARγ-2、脂联素、C/EBPa的表达,诱导MSCs向成骨方向分化并抑制其向脂肪方向分化的能力。