第一部分:补肾法、疏肝法对排卵障碍模型大鼠HPOA的影响目的:通过研究比较补肾法与疏肝法对排卵障碍模型大鼠HPOA影响的异同,探讨补肾法、疏肝法治疗排卵障碍性疾病的作用机制,以丰富中医生殖理论,促进中医妇科学的发展。方法:模型一:选用同批出生9日龄健康雌性SD大鼠204只,体重约15g。随机取170只大鼠,于颈背部皮下一次性注射丙酸睾丸酮1.25mg/只（0.05ml/只）造模。第22日龄断奶,自由进食,同条件饲养。第70日龄阴道开口,造模组连续阴道上皮细胞涂片两个性周期（一个性周期4-5天）,阴道上皮细胞持续角化,提示雄激素致排卵障碍大鼠模型造模成功。余34只,于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05ml作为正常对照组。模型二:选用3月龄健康雌性Wistar大鼠204只,体重180²50g。随机取170只大鼠改进郑家润,梁文波等方法。雷公藤多甙片35mg/kg/d（给药剂量为临床成人用量的20倍）,灌胃法给药,连续57天。造模组连续阴道上皮细胞涂片两个性周期,动情周期转为不规则,主要为周期不完整及周期延长,提示雷公藤致排卵障碍大鼠模型造模成功。其余34只灌胃给蒸馏水作为正常对照组。将两种排卵障碍成功模型大鼠分别随机分为模型组和治疗组,治疗组包括:补肾调经方高剂量组、补肾调经方低剂量组、逍遥丸高剂量组、逍遥丸低剂量组,每组分别各34只;治疗组分别灌服补肾调经方与逍遥丸,模型组和正常组灌服蒸馏水,每日1次。灌胃给药5周,并阴道细胞涂片两个性周期。最后一次给药后禁食8小时,选择相同动情周期（动情前期、动情后期）断头取血,制备血浆、血清,放免法检测血浆卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E₂）、孕酮（P）、睾酮（T）、催乳素（PRL）。同时立即无菌操作,在冰盘上取下部分腺垂体、卵巢、子宫,称重后快速、轻柔地投入预冷的光镜固定液内固定。结果:1造模结果:（1）雷公藤致排卵障碍模型大鼠血清生殖激素与正常组比较,动情前、后E₂降低（均P<0.05）、动情前、后PRL降低（P<0.05,P<0.01）,动情前、后LH升高（均P<0.01）动情后期T升高（P<0.05）、动情前期P升高（P<0.01）。卵巢子宫重量指数与正常组比较无变化（均P>0.05）。对垂体形态、卵巢形态、子宫形态均有轻度异常。（2）雄激素致无排卵模型大鼠血清生殖激素与正常组比较,动情前、后FSH降低（均P<0.01）、动情前期LH降低（P<0.05）,动情前、后PRL升高（均P<0.01）、动情前、后T升高（均P<0.01）、动情前、后E₂升高（均P<0.01）。动情前、后卵巢重量指数、动情前、后子宫重量指数与正常组比较降低（均P<0.01）对垂体形态、卵巢形态、子宫形态均有异常。2补肾法对两种模型大鼠HPOA的影响:（1）雷公藤致排卵障碍模型组补肾法治疗后,与模型组比较,补肾调经低组可使造模大鼠动情后期E₂增加（P<0.05）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前期LH明显降低（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。可使受损的垂体、卵巢、子宫恢复正常。补肾调经高组可使造模大鼠动情前期E₂明显增加（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情后期E₂明显增加（P<0.01）,高于正常（P<0.05）。动情后期PRL增加（P<0.05）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前期P明显降低（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前、后LH降低（P<0.01,P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情后期T降低（P<0.05）,恢复至正常水平（P>0.05）。可使受损的垂体、卵巢、子宫形态恢复正常。（2）雄激素致无排卵模型组补肾法治疗后,与模型组比较,补肾调经低组可使造模大鼠动情前、后FSH增加（P<0.01,P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情后期卵巢重量指数明显增加（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情后期子宫重量指数明显增加（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前、后E₂降低（均P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后PRL明显降低,（均P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前、后T明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。可改善受损的卵巢、子宫、垂体。补肾调经高组可使造模大鼠动情前、后FSH增加（P<0.01,P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前期LH明显增加（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前、后卵巢重量指数明显增加（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后子宫重量指数明显增加（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后E₂明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后PRL明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后T明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。可使受损的卵巢、子宫、垂体基本恢复正常。3疏肝法对两种模型大鼠HPOA的影响:（1）雷公藤致排卵障碍模型组疏肝法法治疗后,与模型组比较,逍遥丸低组可使造模大鼠动情前、后PRL明显增加（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前期LH降低（P<0.01）,恢复至正常水平（P>0.05）。可使受损的垂体、卵巢、子宫形态恢复正常。逍遥丸高组可使造模大鼠动情后期E₂增加（P<0.05）,恢复至正常水平（P>0.05）。动情前、后PRL增加（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。降低造模大鼠动情前期P至正常水平（P>0.05）。动情前、后LH明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。可使受损的垂体、卵巢、子宫形态恢复正常。（2）雄激素补肾法治疗后,与模型组比较,逍遥丸低组可使造模大鼠动情前、后FSH增加（P<0.01,P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。增加造模大鼠动情前期LH至正常（P>0.05）。动情前、后PRL明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后T明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。可改善受损的卵巢、子宫、垂体形态。逍遥丸高组可使造模大鼠动情前期FSH明显增加（P<0.01）,高于正常（P<0.05）。动情后期FSH增加（P<0.05）,恢复至正常水平（P>0.05）。增加造模大鼠动情前期LH高于正常（P<0.05）。增加造模大鼠动情前、后子宫重量指数至正常水平（均P>0.05）。动情后期E₂降低（P<0.05）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后PRL明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。动情前、后T明显降低（均P<0.01）,恢复至正常水平（均P>0.05）。可改善受损的卵巢、子宫、垂体形态。4补肾法、疏肝法对两种模型大鼠HPOA影响的比较:（1）雷公藤致排卵障碍模型组,补肾调经高组可使造模大鼠动情后期E₂高于逍遥丸高组（P<0.05）,动情前期PRL低于逍遥丸高组（P<0.05）,补肾调经低组动情后期E₂明显高于逍遥丸低组（P<0.01）,动情后期LH高于逍遥丸低组（P<0.05）,动情前期PRL低于逍遥丸低组（P<0.05）,动情后期PRL低于逍遥丸低组（P<0.05）在改善卵巢形态方面,补肾调经高、低组卵泡数目,成熟卵泡直径,GC的层数,个数和排列致密程度要优于逍遥丸高、低组。（2）雄激素致无排卵模型组,补肾调经高组动情前、后卵巢重量指数明显高于逍遥丸高组（均P<0.01）,动情后期子宫重量指数高于逍遥丸高组（P<0.05）,补肾调经低组动情前期LH低于逍遥丸低组（P<0.05）。在改善垂体形态方面,逍遥丸高、低组腺垂体腺细胞数量、血窦数量要多于补肾调经高、低剂量组。在改善卵巢形态方面,补肾调经高组外形要粗于逍遥丸高组,卵巢卵泡膜细胞层薄于逍遥丸高组,卵泡数量、卵泡直径、黄体数量要高于逍遥丸高组,GC的层数、数量及排列致密度要高于逍遥丸高组。在改善子宫形态方面,补肾高、低组子宫肌层厚度、腺体的数量、内膜层柱状细胞的连续性和完整性要优于逍遥丸高、低组。第二部分:补肾法、疏肝法对人卵巢颗粒细胞分泌功能的影响目的:通过卵巢颗粒细胞培养,观察两法对卵巢颗粒细胞分泌功能的影响,探讨两法对卵巢自分泌系统的影响,研究排卵障碍的发生与卵巢颗粒细胞分泌功能的关系,比较补肾调经方与逍遥丸对人卵巢颗粒细胞分泌功能影响的异同,为补肾调经方与逍遥丸治疗排卵障碍性疾病的临床应用提供实验依据。方法:取21只6周龄健康雌性大鼠按体重随机分为7组,空白对照组每日灌服生理盐水2ml/100g;补肾调经方组低、中、高剂量组和逍遥丸高、中、低剂量组分别给予补肾调经方和逍遥丸。各组均于末次给药后1小时大鼠股动脉采血。室温静置2h,3000r/min离心10min,取上清,56℃水浴30 min灭活补体,0.22μm无菌滤器过滤除菌、分装,-20℃保存备用。选取年龄在20-30周岁,身体健康,因排卵障碍不孕就诊于河北医科大学中医学院门诊部的女性志愿者4名。B超监测未见成熟卵泡,并且排除卵巢,子宫器质性疾病,双侧输卵管造影结果显示为通畅,近三月未服用激素。分别口服补肾调经方和逍遥丸。连续服药3天,第4天清晨空腹服药（服药前禁食12h）,一次服用全天剂量,于末次给药1小时后静脉取血5ml,室温静置2h,3000r/min离心10min,取上清,56℃水浴30 min灭活补体,0.22μm无菌滤器过滤除菌、分装。空白血清的制备:年龄在20-30周岁,身体健康,月经规律,B超监测有成熟卵泡,并且无卵巢,子宫器质性疾病的女性志愿者1名,清晨空腹静脉采血5ml,,其余同人含药血清制备。-20℃保存备用。将从河北省第二附属医院辅助生殖科取来的含有颗粒细胞的卵泡液经2000r/min离心,弃上清液,沉淀颗粒细胞,用DMEM培养基洗涤后,经密度梯度为0.5Percoll悬液2500 r/min离心30min分离除去红细胞。加入0.25%的胰蛋白酶,37℃消化5-10min左右,加入含有10%胎牛血清和1640培养液终止消化。PBS冲洗,离心。经台盼兰染色细胞存活率85%-90%,用含有10%胎牛血清和1640培养液将颗粒细胞浓度调整为2×105的单细胞悬液,将单细胞悬液放入在24孔的的培养板,每板1ml,在5%的CO2,37℃孵箱中培养。24h后细胞贴壁。分别加入补肾调经方和逍遥丸人含药血清和大鼠含药血清制成高剂量（18%）、中剂量（12%）、低剂量（6%）处理细胞48h。设加正常人和大鼠血清者为空白对照。结果:1补肾调经方含药血清对人黄素化颗粒细胞分泌功能的影响:（1）人含药血清组:①对E₂、P、cAMP水平的影响:与空白组比较,补肾调经高、中、低组E₂高于空白组（P<0.05, P<0.01, P<0.01）。补肾调经中组P明显低于空白组（P<0.01）。补肾调经中、高组cAMP明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,补肾调经高组E₂高于补肾调经中、低组（P<0.05, P<0.01）,补肾调经中组E₂高于补肾调经低组（P<0.01）。补肾调经高、低组P高于补肾调经中组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经中、高组cAMP明显高于补肾调经低组（均P<0.01）。②对FSHR表达的影响:蛋白印迹法:补肾调经高、中、低组FSHR表达均高于空白组,补肾调经高、中组FSHR表达要高于补肾调经低组。RT-PCR法:与空白组比较,补肾调经中、高组FSHR表达明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,补肾调经中FSHR值明显高于补肾调经高、低组（均P<0.01）,补肾调经高组FSHR明显高于补肾调经低组（P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:与空白组比较,补肾调经中、高组P450表达高于空白组（P<0.01,P<0.05）。补肾调经高、中、低组PPARγ表达低于空白组（均P<0.01）。两两比较,补肾调经中组P450表达明显高于补肾调经高、低组（均P<0.01）。补肾调经低、中组PPARγ表达明显低于补肾调经高组（均P<0.01）。（2）大鼠含药血清组,①对E₂、P、cAMP水平的影响:与空白组比较,补肾调经高、中组E₂高于空白组（均P<0.01）。补肾调经中组P明显低于空白组（P<0.01）。补肾调经中、高组cAMP明显高于空白组（P<0.05,P<0.01）。两两比较,补肾调经高、中组E₂高于补肾调经低组（均P<0.01）。补肾调经中组P低于补肾调经高、低组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经高组cAMP高于补肾调经低组（P<0.05）。②对FSHR表达的影响:蛋白印迹法:补肾调经高、中、低组FSHR表达均高于空白组,补肾调经高、中组要高于补肾调经低组。RT-PCR法:与空白组比较,补肾调经中、高组FSHR表达明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,补肾调经中、高组FSHR表达明显高于补肾调经低组（均P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:与空白组比较,补肾调经中、高组P450表达高于空白组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经中组PPARγ表达明显低于空白组（P<0.01）。两两比较,补肾调经高组P450表达高于补肾调经低、中组（P<0.01,P<0.05）。补肾调经中组PPARγ表达明显低于补肾调经低、高组（P<0.05,P<0.01）。2逍遥丸含药血清对人黄素化颗粒细胞分泌功能的影响（1）人含药血清组:①对E₂、P、cAMP水平的影响:与空白组比较,逍遥丸高、中、低组E₂高于空白组（均P<0.01）。逍遥丸高组P明显低于空白组（P<0.05）。逍遥丸低、中、高组cAMP明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,逍遥丸高组E₂高于逍遥丸低组（P<0.01）。逍遥丸高组cAMP明显高于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。②对FSHR表达的影响:蛋白印迹法:逍遥丸高、中、低组表达均高于空白组,逍遥丸高组高于逍遥丸低、中组,逍遥丸中组高于逍遥丸低组。RT-PCR法:与空白组比较,逍遥丸中、高组FSHR表达明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,逍遥丸高组FSHR高于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:与空白组比较,逍遥丸中、高组P450表达明显高于空白组（P<0.01,P<0.05）。逍遥丸高、中、低组PPARγ表达低于空白组（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。两两比较,逍遥丸高、中组P450表达明显高于逍遥丸低组（均P<0.01）。逍遥丸中、低组PPARγ表达低于逍遥丸高组（P<0.01,P<0.05）。（2）大鼠含药血清组:①对E₂、P、cAMP水平的影响:与空白组比较,逍遥丸高、中组E₂高于空白组（ P<0.01, P<0.01,P<0.05）。逍遥丸高组P明显高于空白组（P<0.05）。逍遥丸中、高组cAMP明显高于空白组（均P<0.01）。两两比较,逍遥丸高组E₂高于逍遥丸低、中组（均P<0.01）,逍遥丸中组E₂明显高于逍遥丸低组（P<0.01）。逍遥丸中、低组P明显低于逍遥丸高组（均P<0.01）。逍遥丸高组cAMP高于逍遥丸中、低组（P<0.05,P<0.01）。②对FSHR表达的影响。蛋白印迹法:逍遥丸高、中、低组表达均高于空白组,逍遥丸高组高于逍遥丸低、中组,逍遥丸中组高于逍遥丸低组。RT-PCR法:与空白组比较,逍遥丸高组FSHR表达明显高于空白组（P<0.01）。两两比较,逍遥丸高组高于逍遥丸中、低组（P<0.05,P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:与空白组比较,逍遥丸高组P450表达高于空白组（P<0.05）。逍遥丸中组PPARγ表达明显低于空白组（P<0.01）。3两种含药血清对人黄素化颗粒细胞分泌功能影响的比较:（1）人含药血清组:①对E₂、P、cAMP水平的影响:补肾调经低组E₂低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经中组E₂高于逍遥丸低组（P<0.05）。补肾调经高组E₂高于逍遥丸高、中、低组（均P<0.01）。补肾调经中组P低于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。补肾调经低组cAMP低于逍遥丸高、中组（均P<0.01）。补肾调经中组cAMP高于逍遥丸低组（P<0.05）,低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经高组cAMP低于逍遥丸高组（P<0.01）。②对FSHR表达的影响。蛋白印迹法:补肾调经高、中、低组FSHR的表达均高于相应的逍遥丸高、中、低组。且补肾调经低组FSHR的表达高于逍遥丸高组FSHR的表达。RT-PCR法:补肾调经低组FSHR的表达低于逍遥丸高、中组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经中组FSHR的表达高于逍遥丸高、中、低组（均P<0.01）。补肾调经高组FSHR的表达高于逍遥丸低、中组（均P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:补肾调经低组P450低于逍遥丸中、高组（P<0.01,P<0.05）。补肾调经中组P450高于逍遥丸低组（P<0.01）。补肾调经高组P450高于逍遥丸中、低组（均P<0.05）。补肾调经低组PPARγ低于逍遥丸高组（P<0.05）。补肾调经中组PPARγ高于逍遥丸低组（P<0.05）,低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经高组PPARγ高于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。（2）大鼠含药血清组:①对E₂、P、cAMP水平的影响:补肾调经低组E₂低于逍遥丸高、中组（均P<0.01）。补肾调经中组E₂高于逍遥丸中、低组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经高组E₂高于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。补肾调经低组P低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经中组P低于逍遥丸中、高组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经高组P低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经低组cAMP低于逍遥丸高、中组（均P<0.01）。补肾调经中组cAMP低于逍遥丸高组（P<0.01）。补肾调经高组cAMP低于逍遥丸高组（P<0.01）。②对FSHR表达的影响。蛋白印迹法:补肾调经中、低组人黄素化颗粒细胞FSHR的表达均高与相应的逍遥丸中、低组。且补肾调经中组人黄素化颗粒细胞FSHR的表达高于逍遥丸高、中、低组FSHR的表达。RT-PCR法:补肾调经低组FSHR的表达低于逍遥丸高组（P<0.05）。补肾调经中组FSHR的表达高于逍遥丸中、低组（P<0.05,P<0.01）。补肾调经高组FSHR的表达高于逍遥丸中、低组（均P<0.01）。③对P450、PPARγ表达的影响:补肾调经低组P450低于逍遥丸中、高组（P<0.01,P<0.05）。补肾调经中组P450高于逍遥丸低组（P<0.01）。补肾调经高组P450高于逍遥丸低、中、高组（均P<0.05）。补肾调经中组PPARγ低于逍遥丸低、高组（均P<0.05）。补肾调经高组PPARγ低于逍遥丸中组（P<0.05）。结论:（1）两种排卵障碍模型血清生殖激素均紊乱,垂体、卵巢、子宫形态均有异常;雄激素致无排卵模型卵巢、子宫重量指数降低。雄激素致无排卵模型对卵巢、子宫形态及重量指数降低要重于雷公藤致排卵障碍模型。（2）补肾法、疏肝法通过改善垂体、卵巢、子宫形态,调节生殖内分泌激素水平,增加卵巢、子宫重量指数,发挥促进卵泡发育和成熟,治疗排卵障碍性疾病的作用。补肾法在改善卵巢、子宫形态,增加卵巢、子宫重量指数,调节卵巢分泌血清生殖激素方面优于疏肝法,疏肝法在改善垂体形态,调节垂体分泌血清生殖激素方面优于疏肝法。（3）补肾法、疏肝法可以改善人卵巢黄素化颗粒细胞分泌功能,调节卵巢的自分泌系统,达到改善卵巢功能的作用。补肾法在提高人卵巢黄素化颗粒细胞E₂、FSHR,降低PPARγ水平及表达方面优于疏肝法,疏肝法在提高人卵巢黄素化颗粒细胞cAMP水平方面法优于补肾法