伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是威胁全球养猪业的重大疫病之一,其病原体为猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）。我国从2011年开始,伪狂犬病毒出现了变异,传统的疫苗可能不能提供完全保护,开发新型有效的疫苗是目前的猪伪狂犬病的防控重任。活疫苗黏膜免疫后产生保护反应,但黏膜抗体难以评价,黏膜免疫主要产生分泌型免疫球蛋白A（Immunoglobulin A,IgA）,其具有广泛的免疫保护作用,IgA抗体是评价疫苗黏膜免疫反应的主要指标,而现在国内外尚无针对猪伪狂犬病毒IgA抗体的ELISA检测试剂盒。本研究利用表达的伪狂犬病毒gB蛋白作为包被抗原,来建立猪伪狂犬病毒IgA抗体间接ELISA方法,为疫苗黏膜免疫效果评价提供一种基础方法。灭活疫苗具有安全性高,与活疫苗相比不易引起散毒的优点,但灭活疫苗不易产生鼻腔黏膜免疫反应,抗原需搭配合适的黏膜佐剂制成疫苗进行滴鼻免疫。本研究将两种免疫佐剂与抗原混合,制备几种灭活疫苗在小鼠上进行初步试验,为新疫苗的研制奠定了基础。本研究首先建立伪狂犬病毒IgA抗体间接ELISA检测方法。用PCR方法截短扩增猪伪狂犬病病毒gB基因片段,将其克隆入pGEX-6P-1表达质粒,重组质粒转化入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌,采用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,可溶性重组蛋白gB获得了表达。重组蛋白gB经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后,作为ELISA方法建立所用抗原,以PRV阴阳性猪的肺泡灌洗液作为标准品,羊抗猪IgA-HRP为二抗,并对主要反应条件进行了优化,建立了猪伪狂犬病毒IgA抗体间接ELISA方法。利用该间接ELISA方法对PRV活疫苗黏膜免疫的仔猪进行检测,结果显示在鼻腔黏液中可检测出特异性PRV IgA抗体。本试验为PRV疫苗黏膜免疫评价提供了初步检测方法。有研究表明,Gel 01黏膜佐剂和VA5免疫增强剂可显著提高猪用和禽用疫苗黏膜免疫效果。本研究选用Gel 01黏膜佐剂和VA5免疫增强剂与PRV灭活抗原配制疫苗,在小鼠模型上评价两种黏膜佐剂对PRV灭活抗原黏膜免疫促进作用。即将猪伪狂犬病毒gE/gI基因缺失株灭活后,与免疫增强剂VA5和黏膜佐剂Gel 01混合制成不同组别疫苗,包括灭活病毒液加Gel 01组（V+Gel 01组）、灭活病毒液加VA5组（V+VA5组）、灭活病毒液加Gel 01和VA5组（V+Gel 01+VA5组）、灭活病毒液组（V组）和空白对照组（PBS组）。免疫后不同时间段采集小鼠血清和肺泡灌洗液,检测其中的特异性抗体水平,并在免疫后28天使用猪伪狂犬病毒野毒株进行攻毒,记录小鼠死亡情况。结果显示,小鼠免疫V+Gel 01+VA5疫苗后,肺泡灌洗液中的特异性IgG和IgA抗体水平均显著高于其他疫苗免疫组,且血清中的特异性抗体水平也有显著提升;对小鼠进行攻毒后,V+Gel 01+VA5疫苗免疫组小鼠的存活率可达100%。试验表明,VA5免疫增强剂和Gel 01黏膜佐剂联用能显著增强猪伪狂犬病毒灭活抗原局部黏膜免疫和全身体液免疫,并有较好的攻毒保护效果,可以初步将其作为猪伪狂犬病的一种候补疫苗。