前言寄生虫学是一门以形态学研究为主的学科,依靠显微镜进行形态学检查的传统分类鉴定方法已经满足不了日趋复杂多样的寄生虫进化、种属分类以及流行病学研究。分子生物学方法的引入,使得分子寄生虫学(Molecular Parasitology)得到了长足的发展,目前已成为现代寄生虫学最重要的学科分支和学科研究的前沿领域。应用分子寄生虫学方法,可从基因水平对寄生虫进行种属鉴定与分类,从分子水平认识寄生现象,探讨寄生虫入侵宿主的分子机制,寻找抗寄生虫药物的分子靶标,分离和鉴定诊断用特异性抗原分子和疫苗候选抗原分子,以解决寄生虫病的诊断、治疗和预防等问题。目前,用于研究寄生虫种属鉴定与分类的基因有多种,包括核DNA、线粒体DNA、动基体DNA和质体DNA等,其中线粒体DNA(cytb、cox1、cox3、nad1、nad4等)及核糖体DNA(ITS1、ITS2、rrnS等)已被广泛应用于对寄生虫遗传结构及亲缘关系的分析研究中。特别是线粒体DNA因具有分子较小、结构简单、进化速率高和母性遗传等特点,尤其适合作为遗传学研究的标记,其中细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因已被广泛认可,应用于猬迭宫绦虫遗传变异的研究中。Milad等通过cox1基因比对分析,证实伊朗1例猫源裂头蚴为猬迭宫绦虫;Simpson等应用cox1基因分析发现澳大利亚1例狗源裂头蚴为虚假迭宫绦虫;Jeon等用多重PCR和cox1基因测序方法研究了中国和韩国两国蛇源裂头蚴,结果表明全部共904条裂头蚴样本都归属于虚假迭宫绦虫;Jeon等最近通过形态学和部分cox1基因鉴定了韩国人体裂头蚴病的病原体有猬迭宫绦虫和虚假迭宫绦虫;Tang等通过cox1基因和28S rRNA基因鉴定,对9例香港人裂头蚴进行回顾性分析,9个样品均被确认为猬迭宫绦虫。截至目前,确认能感染人的裂头蚴有猬迭宫绦虫和虚假迭宫绦虫,韩国已有以上两种虫种的报道。我国迄今仅有猬迭宫绦虫一种报道,其中辽宁和湖北两地裂头蚴的报道仅限于人体病例报告或动物感染率检测,尚缺乏基因分析及确切的虫种鉴定依据,是归属于猬迭宫绦虫还是虚假迭宫绦虫?是否与地理位置相近的韩国分离株基因型一致?目前确定能引起人体感染的吸吮线虫有三种,即结膜吸吮线虫(T.callipaeda)、加里福尼亚吸吮线虫(T.californiensis)和最近发现的大口吸吮线虫(T.gulosa),不同种属的吸吮线虫在虫体形态、地域分布方面存在差异。中国是吸吮线虫病报道最多的国家,报告病例数近千例,且只有结膜吸吮线虫一种。此前的病例报告主要依据形态学特征或临床症状进行诊断,不能反应出因受环境因素(自然、地理、气候等)长期影响,不同种株间产生的遗传进化关系间的区别,而通过DNA序列分析来鉴定寄生虫虫种和遗传变异情况则弥补了形态学分析的不足。本研究选用了cox1基因为分子标记,对裂头蚴及结膜吸吮线虫进行了基因鉴定,并分别对两种寄生虫的亲缘关系进行分析,首次明确了我国辽宁和湖北两地流行的人源和蛙源裂头蚴的基因型,获得的资料对两种少见寄生虫病的流行病学调查具有重要意义,为该裂头蚴病及结膜吸吮线虫病的种属分类、鉴别诊断、预防控制等更深入的研究奠定基础。研究方法一、形态学检查1、将虫体置于含生理盐水的平皿中,观察虫体的大体形态,显微镜下观察微细结构。2、再行HE/盐酸卡红染色,观察各部位的解剖结构、组织学特征,之后将虫体于75%乙醇溶液4℃保存。二、基因测序1、虫体DNA提取:从保存液中取出虫体,用组织剪剪碎,然后用SDS/蛋白激酶K(20mg/mL,20μL)消化,常规酚氯仿法提取基因组DNA,加入TE缓冲液,-20℃保存。2、扩增目的片段:以cox1基因为分子标记,查阅文献选取引物,PCR扩增得到目的片段。3、基因测序:取扩增产物经电泳观察目的条带,并送上海生工生物有限公司进行基因测序。三、测序结果的分析及比对1、采用ContigExpress软件对获得的序列进行拼接,然后经BioEdit软件进行人工校正,用BLAST软件与基因库中文献进行同源性比较。2、结合GenBank中已登录的同科虫种线粒体cox1基因信息,应用DNAStar软件进行多重序列比对,了解其种间及种内变异情况。四、系统发育分析选取GenBank中部分同科虫种线粒体cox1基因,利用MEGA7.0软件以最大简约法(Maximum Parsimony,MP)、邻接法(Neighbor Joining method,NJ)及最大似然树(Maximum Likelihood,ML)绘制种系发育树,自展值(Bootstrap)重复抽样1000次。结果一、形态学鉴定结果1、7例裂头蚴长9.8cm~15.1cm、宽为0.3cm~0.4cm,活虫体为乳白色,不分节,但具横纹,活体伸缩活动能力强;虫体头部具有吸槽,体部具有排列不规则的横皱褶,体腔内的石灰小体和细行的肌束,初步鉴定为曼氏迭宫绦虫。2、2例结膜吸吮线虫外观细长呈线状、乳白色、半透明,成虫头端及尾端圆钝,虫体表面具有明显的锯齿状横纹,前端有一典型的六角形梯状口腔,支持其形态学诊断。二、基因鉴定结果1、辽宁与湖北7例虫体经巢式PCR扩增均得到大小为390bp的cox1基因片段,BLAST同源性分析结果显示与欧猬迭宫绦虫(KJ599680.1)同源(97%~99%),与虚假迭宫绦虫(KJ599679.1)、S.ranarum差异明显(12%~13%)。DNAStar软件分析7个虫体间cox1基因一致性97%~100%,人源及蛙源cox1基因之间没有明显差别(1%~3%),两地cox1基因之间没有明显差别(0~2%),而与裂头属的种间差异较大为(12%~29%)。2、辽宁1例与山东1例虫体扩增均得到大小为689bp的cox1基因片段,BLAST同源性分析的结果显示与结膜吸吮线虫线粒体全基因组的一致性(Similarity Index)均为99%;2例标本一致性为98.3%,13个碱基突变位点(G/A位于89、149、206、221、236、467、473、608;C/T位于39、47、225、401、539)。三、系统发育分析1、应用MP法、NJ法与ML法构建种系发育树拓扑结构基本一致,仅在自展值有所差异,辽宁分离株(LNZH1、LNDD1、LNJZ1及LNJZ2)和湖北分离株(HBXG1、HBHH1及HBXN1)具有高度同源性,与韩国猫源分离(KJ599680.1)位于同一分枝,与其他绦虫所属分支相隔较远。2、辽宁人源结膜吸吮线虫与意大利犬源(AM042555.1)属于同一分支,与欧洲株同源,且2例标本一致性为99.1%,6个碱基突变位点(G/T位于8;G/A位于311、468;C/T位于39、47、401);山东人源结膜吸吮线虫与罗马尼亚犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利猫源(KX372681.1)及塞尔维亚猫源(KJ433983.1)属于同一大分支,亦与欧洲株同源,一致性为99.6%,3个碱基突变位点(G/T位于8;G/A位于221、257)。结论1、辽宁及湖北两地7例疑似裂头蚴分离株经形态学和基因型分析均被确定为欧猬迭宫绦虫(S.erinaceieuropaei)。2、辽宁及山东两地2例疑似结膜吸吮线虫分离株经形态学和基因型分析均被确定为结膜吸吮线虫。3、系统发育分析表明辽宁及湖北裂头蚴分离株(人源、蛙源)与韩国猫源分离株(KJ599680.1)位于同一分枝,与韩国犬源分离株(KJ599679.1)相对较远,第一次明确了两个地区裂头蚴基因型。4、辽宁及山东两地人源结膜吸吮线虫与欧洲动物源分离株同源,与本课题组既往研究结果一致。5、不同地域、宿主来源的cox1基因种内保守,种间存在不同程度的变异,验证了其可作为寄生虫的分子诊断标记。