FOXM1介导FSH促进卵巢癌细胞迁移及其机制的研究

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目的:  探索卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)对卵巢上皮癌细胞系OVCAR-3细胞迁移的影响及机制,研究FOXM1在FSH促进卵巢癌细胞迁移中的作用。  方法:  用Western Blot技术分析人卵巢癌细胞株OVCAR-3、SKOV3、HO8910、HO8910PM、HEY细胞中FSHR和FOXM1的蛋白表达。Transwell细胞迁移实验检测OVCAR-3及HO8910PM细胞在FSH刺激后细胞迁移能力的变化。Real time PCR技术、Western Blot技术以及免疫荧光技术分别检测FOXM1在FSH作用下mRNA、蛋白表达的变化及分布情况。实验设计合成两组针对人FOXM1基因的小干扰RNA(siRNA),构建FOXM1-siRNA(siRNA#1组和RNA#2组)实验组及阴性对照siRNA(Ctrl siRNA组),体外通过Real time PCR和Western blot技术检测三组细胞的FOXM1mRNA及蛋白的表达,Transwell细胞迁移实验检测三组细胞的迁移能力;Western Blot技术检测OVCAR-3细胞在不同FSH浓度作用下,PKA、ERK蛋白的磷酸化表达水平。FSH联合PKA抑制剂(H-89)和ERK抑制剂(U0126)处理OVCAR-3细胞,检测FOXM1总蛋白、FOXM1核浆蛋白、P-PKA、P-ERK蛋白表达量。最后通过Real time PCR技术分别检测在转染FOXM1siRNA及抑制剂作用下,FSH对FOXM1下游基因VEGFA,MMPs mRNA的影响。  结果:  1.卵巢癌细胞株OVCAR-3、SKOV3、HO8910、HO8910PM、HEY细胞中FSHR和FOXM1的蛋白表达水平中,OVCAR-3细胞均表达较高,而HO8910PM细胞的FSHR蛋白表达水平较低,故选取OVCAR-3细胞进行后续实验,同时以HO8910PM作为对照细胞。在OVCAR-3细胞中,随着FSH浓度的增加,Transwell细胞迁移实验结果显示其细胞迁移能力显著增加(P<0.05),而在HO8910PM细胞中细胞迁移能力未发生明显变化。  2. Western Blot技术显示FSH处理OVCAR-3细胞后,FOXM1的蛋白表达呈现明显递增趋势(P<0.05),且细胞核中的FOXM1蛋白表达较细胞浆中多。  3.免疫荧光实验结果显示在FSH(100mIU/ml)作用下,相对胞浆而言,胞核内的 FOXM1表达显著增加。  4.特异性FOXM1-siRNA:siRNA#1与siRNA#2可明显抑制FOXM1的表达,在OVCAR-3细胞中,相对Ctrl siRNA组(对照组),Western Blot结果显示siRNA#1、siRNA#2组(实验组)中FOXM1蛋白表达量分别为(0.048±0.004)、(0.072±0.006)(P<0.05),差异有统计学意义。同时Transwell细胞迁移实验结果显示实验组细胞迁移能力显著下降。  5.Western Blot技术显示随着FSH浓度增加,ERK、PKA的蛋白磷酸化水平呈现明显递增趋势(P<0.05)。  6.在 PKA抑制剂H-89(20umol/ml)和ERK抑制剂U0126(10umol/ml)作用下,FSH促进FOXM1、P-ERK、P-PKA蛋白表达作用降低,同时核浆蛋白结果显示FSH促进细胞核FOXM1蛋白表达作用降低。  7.免疫荧光结果显示,在 PKA抑制剂H-89(20umol/ml)和ERK抑制剂U0126(10umol/ml)作用下,FSH促进FOXM1胞核表达的能力明显降低。  8.Real time PCR结果显示特异性FOXM1-siRNA:siRNA#1与 siRNA#2可明显抑制 FOXM1及其下游基因 MMP9,VEGFA的 mRNA表达(P<0.01)。在靶向沉默FOXM1基因及PKA抑制剂H-89(20umol/ml)和ERK抑制剂U0126(10umol/ml)作用后,FSH对MMP9、VEGFA mRNA表达的促进作用明显减弱。  结论:  FSH通过促进PKA、ERK磷酸化,上调FOXM1在卵巢上皮癌细胞中表达,激活FOXM1下游基因MMPs、VEGFA的表达促进细胞的迁移,最终促进细胞的迁移。
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