多氯联苯(Polychlorinated diphenyls,PCBs)作为一类持久性有机污染物(Persistent organic pollutants,POPs),是一种曾被广泛用于工业的卤代烃类化合物。由于PCBs的不适当的处理使得它们进入环境并且不断积累,对人类健康造成危害。五氯联苯PCB126是一种二噁英类多氯联苯(dioxin-like PCB),有较强的毒性。肝癌是一种恶性肿瘤,其发病率有增长的趋势。流行病学调查表明,肝癌的发生和PCBs的暴露有一定的联系,但PCBs暴露促进肝癌发病的分子机制并不清楚。本研究旨在探究五氯联苯PCB126暴露对人肝癌细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)和有氧糖酵解的影响及分子机制,从而为评价PCB126与肝癌发展的相关性提供一定的理论依据。本文的研究包括以下几部分:第一部分:用10-11~10-7 M的PCB126处理肝癌细胞SMMC-7721和Bel-7402 24和48 h后,采用qRT-RCR检测细胞中EMT关键蛋白的表达,通过MTT方法检测PCB126对细胞存活的影响。结果表明,10-10、10-9和10-8 M PCB126处理细胞48 h后,EMT的关键蛋白钙黏着蛋白E-cadherin表达降低,N-cadherin和波形蛋白Vimentin表达明显增加。MTT分析表明PCB126在这些浓度下对细胞存活没有明显影响。形态观察发现,暴露药物细胞的形态发生改变。细胞粘附实验显示,PCB126暴露导致细胞间粘附率显著减少。这些结果表明PCB126暴露促进肝癌细胞发生EMT。第二部分:用用10-10、10-9和10-8 M PCB126处理SMMC-7721和Bel-7402细胞48 h后,检测细胞内STAT3、p-STAT3和Snail1的水平。结果表明PCB126暴露提高肝癌细胞中STAT3和p-STAT3的蛋白表达,Snail1 mRNA水平和核内的p-STAT3水平。这些结果表明STAT3/Snail1信号通路被激活。加入STAT3的抑制剂WP1066后发现PCB126诱导的EMT被逆转。此外,PCB126处理提高PKM2的表达并促进其核转位。为了进一步证明PKM2在STAT3/Sanil1信号介导的EMT过程中的作用,利用RNA干扰技术敲减PKM2。结果表明敲减PKM2明显抑制PCB126诱导的p-STAT3的上调,并且PCB126诱导的细胞上皮间充质转化被明显抑制。以上结果表明PCB126调控PKM2激活STAT3/Sanil1信号通路从而诱导肝癌细胞发生EMT。第三部分:用用10-10、10-9和10-8 M PCB126处理SMMC-7721和Bel-7402细胞48 h后发现细胞内芳香烃受体AhR以及其下游基因CYP1A1的mRNA表达量上调。为了检测AhR在PCB126诱导的细胞EMT中的作用,利用shRNA敲减AhR。结果表明,AhR敲减后,PCB126暴露引起的PKM2的mRNA和蛋白表达增加被抑制,STAT3/Snail1信号通路也被抑制,并且PCB126诱导的EMT被明显抑制。同时,PCB126暴露以后细胞内的ROS水平显著提高。使用ROS抑制剂NAC处理细胞以后,PCB126暴露激活的PKM2/STAT3/Snail1信号通路和细胞EMT都被逆转。此外,AhR敲减后,ROS水平也明显降低。以上结果表明,PCB126可以通过AhR途径激活PKM2/STAT3/Snail1信号通路进而诱导肝癌细胞发生EMT。第四部分:为了探究雌激素受体ER是否参与到PCB126诱导的细胞上皮间充质转化的过程,我们用ER的抑制剂ICI 182780处理细胞。结果表明,清除ER信号后,细胞EMT得到逆转,PKM2的表达和核转位减少,STAT3/Snail1信号通路被抑制。以上结果表明ER参与PCB126暴露引起的肝癌细胞EMT过程。第五部分:为了探讨PCB126对肝癌细胞有氧糖酵解的影响和机制。以SMMC-7721为实验材料,分别用10-11~10-7M PCB126处理24和48h,利用试剂盒检测培养基中葡萄糖的含量和乳酸的生成量,实时荧光定量PCR法检测PKM2和有氧糖酵解通路中关键因子的表达。结果发现PCB126暴露明显减少培养基中葡萄糖含量,提高乳酸的生成量,并且提高PKM2、葡萄糖转运蛋白1、乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶激酶mRNA水平。利用RNA技术敲减PKM2后PCB126暴露引起的有氧糖酵解得到抑制。这些结果表明PCB126通过PKM2促进细胞有氧糖酵解。综上所述,PCB126通过ER和AhR途径激活PKM2/STAT3/Snail1信号通路,从而改变EMT关键因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达,最终促进肝癌细胞EMT的发生。此外,PCB126通过调控PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解。这些研究结果可能是关于PCB126促进肝癌发展的重要机制。