论文部分内容阅读
目的:观察补中益气汤含药血清对发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的A549细胞侵袭转移程度以及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、整合素β1(Integrin-β1)的表达变化,探讨补中益气汤对肺癌EMT过程中侵袭和转移的作用及相关机制,为培土生金法方药补中益气汤抑制肺癌上皮-间质转化提供实验依据。材料与方法:采用血清药理学方法制备含药血清,将40只SD大鼠按照随机对照方法分为4组,分别为空白血清组(10 ml·kg-1)和补中益气汤低剂量含药血清组(11.34g·kg-1)、补中益气汤中剂量含药血清组(5.67 g·kg-1)、补中益气汤高剂量含药血清组(2.84 g·kg-1),每日灌胃一次,连续灌胃三天后提取大鼠血清,过滤灭菌后,用于后续实验。肺腺癌A549细胞分为空白血清组(未加TGF-β1)、TGF-β1诱导组、补中益气汤高剂量含药血清+TGF-β1组、补中益气汤中剂量含药血清+TGF-β1组和补中益气汤低剂量含药血清+TGF-β1组。体外培养A549细胞,用TGF-β1进行干预,细胞形态学检测TGF-β1诱导A549细胞后形态的改变;细胞迁移实验检测补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞迁移能力的影响;MTT法检测补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞的抑制率,细胞可分组为:空白血清组、TGF-β1诱导组、补中益气汤高剂量、中剂量、低剂量含药血清+TGF-β1组、空白对照组(加空白培养液,未加细胞)及细胞对照组(不加含药血清,只加细胞悬液);Western blot方法、细胞免疫化学方法及Real-time PCR法检测MMP-9、整合素β1在蛋白及m RNA水平上的表达。采用SPSS17.0统计学软件对数据进行处理,计量资料数据用均数±标准差(X±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.TGF-β1诱导之后,与正常肺腺癌A549细胞比,形态学上发生了明显的EMT的改变,细胞由鹅卵石状上皮形态变成梭形、纺锤形,细胞和细胞之间的连接变得松散,其细胞间隙略变大,细胞出现伪足,并且侵袭能力增强。2.MTT法测定补中益气汤含药血清对TGF-β1诱导的A549细胞的抑制率,补中益气汤高、中、低剂量含药血清+TGF-β1组对A549细胞的抑制率明显高于TGF-β1诱导组(P<0.01),差异具有统计学意义,与空白血清组相比,差异也具有统计学意义(P<0.01)。3.细胞划痕12 h后,补中益气汤高、中剂量含药血清能抑制TGF-β1诱导之后细胞的侵袭迁移(P<0.05),补中益气汤低剂量含药血清抑制作用不明显(P>0.05);划痕24 h后,TGF-β1诱导组侵袭迁移能力比空白血清组增快(P<0.01),差异有统计学意义,而补中益气汤高、中、低剂量含药血清皆可抑制A549细胞的侵袭迁移(P<0.01)。4.免疫细胞化学方法检测MMP-9及整合素β1在A549细胞中的定位及表达,MMP-9及整合素β1蛋白表达均位于细胞浆,呈棕黄色颗粒状,与空白血清组相比,TGF-β1诱导组细胞浆中棕黄色颗粒明显增多(P<0.01),差异有统计学意义;与TGF-β1诱导组相比,补中益气汤高、中、低剂量含药血清+TGF-β1组中棕黄色颗粒表达减少(P<0.01),差异有统计学意义。5.Western blot技术检测MMP-9及整合素β1在A549细胞中的表达,TGF-β1诱导组MMP-9、整合素β1表达呈强阳性,明显高于空白血清组(P<0.05),差异有统计学意义;与TGF-β1诱导组相比,补中益气汤高、中、低剂量含药血清+TGF-β1组中整合素β1的表达下调(P<0.05),差异有统计学意义,补中益气汤高、中剂量含药血清+TGF-β1组中MMP-9的表达下调(P<0.01),差异有统计学意义,而补中益气汤低剂量含药血清+TGF-β1组中MMP-9的表达下调不明显(P>0.05)。6.Real-time PCR法检测MMP-9及整合素β1在A549细胞中m RNA的表达,A549细胞经TGF-β1诱导之后,与空白血清组相比,MMP-9及整合素β1的m RNA的表达量呈上调趋势(P<0.01),差异有统计学意义;与TGF-β1诱导组相比,补中益气汤高、中、低剂量含药血清+TGF-β1组中m RNA的表达量下调(P<0.01),差异有统计学意义。结论:1.补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞上皮-间质转化过程中侵袭转移的能力具有明显的抑制作用。2.补中益气汤含药血清对A549细胞的MMP-9、整合素β1的蛋白表达有下调作用,蛋白下调之后表达水平与A549细胞蛋白表达水平类似。补中益气汤可在一定程度上抑制肺腺癌A549细胞的侵袭及转移,这可能跟下调TGF-β1介导的A549细胞内转移相关蛋白MMP-9、整合素β1蛋白表达有关。3.补中益气汤含药血清对A549细胞的MMP-9、整合素β1的m RNA表达有下调作用,m RNA下调之后表达水平与A549细胞m RNA表达水平类似。补中益气汤可在一定程度上抑制肺腺癌A549细胞的侵袭及转移,这可能跟下调TGF-β1介导的A549细胞内转移相关蛋白MMP-9、整合素β1m RNA表达有关。