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背景:在外科手术中,为了减轻缺血再灌注损伤对器官影响,研究先后发现了缺血预处理(Ischemic Preconditioning,IPC)和远端缺血预处理(Remote Ischemic Preconditioning,RIPC)现象。目前RIPC的保护作用仍具有争议性,并且其作用机制和体液因子有待进一步明确。研究发现缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factor-1,HIF-1)和肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)可能参与RIPC的作用。为此,本研究主要探讨RIPC对缺血再灌注后肾功能是否具有保护作用,并进一步明确HIF-1和ADM在其中的作用。材料与方法:采用雄性Sprague-Dawley大鼠,在第一部分第一节建立急性肾缺血再灌注损伤模型。在第一部分第二节随机分成4组并对其中两组分别予以即刻RIPC预处理和延迟RIPC预处理,比较二者保护作用差异和HIF-1表达。在第二部分观察各组在分别予以抑制剂YC-1,激动剂DMOG和ADM溶液进行药物干预后,RIPC的保护作用差异以及HIF-1和ADM的表达变化。结果:1.在第一部分第一节中,采取左肾夹闭45 min右肾摘除干预的实验组的肾功能指标和氧化损伤指标急剧升高,肾小管评分较高,在24 h内损伤逐渐加重。2.在第一部分第二节中,即刻RIPC和延迟期RIPC干预组在各项肾功能和氧化损伤指标上较缺血再灌注组显著改善,并且延迟期RIPC具有较好的保护效果。此外,延迟期RIPC具有较高的HIF-1表达,血液中ADM水平亦显著升高。3.在第二部分中,经ADM干预的实验组较缺血再灌注组具有一定的改善,但其不及延迟期RIPC组。激动剂DMOG组较其他各组具有较好的保护效果。结论:采取左肾缺血45 min,右肾摘除的方式可以建立合适的急性肾缺血再灌注损伤模型。经肢端远端缺血预处理在一定程度上为急性肾缺血再灌注损伤后肾功能提供保护作用,并且延迟期RIPC预处理具有较好的保护效果。此外,HIF-1参与RIPC的保护作用,外源性ADM对缺血再灌注后肾脏显示部分保护作用,但其具体的作用机制需要更深入的研究。第一部分第一节:急性肾缺血再灌注模型建立背景:急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是一种常见的临床综合征,主要表现为肾功能的急性快速下降及代谢废物的累积。在外科手术中,因器官缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤是临床上常见的一种术后并发症,它可导致术后死亡率升高。因此在开展急性肾缺血再灌注损伤研究的基础是建立合适的动物模型。本研究中采用雄性Sprague-Dawley大鼠,在预实验基础上,综合既往研究的实验方案,建立合适的急性肾缺血再灌注模型。材料与方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为2组:1.假手术组(Sham):开腹,只分离左右两侧肾蒂,关腹。2.急性缺血再灌注组(IR):开腹,分离左右两侧肾蒂,采用微创血管夹夹闭左侧肾蒂的同时摘除右侧肾脏,夹闭45 min后,松开血管夹,恢复血液灌流,关腹。所有分组在术后6 h和24 h时间节点分别处死并进行相应的标本收集来检测血液中的肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)和肾组织中的髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),对左肾组织行苏木精—伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)评估病理变化并进行肾小管评分。结果:1.从肾功能指标Cr、BUN和氧化损伤指标MPO、MDA、SOD和肾小管评分来看,IR组均较Sham组在6 h和24 h这两个时间节点均显著升高(P<0.001),肾脏损伤加重。2.在术后24 h内,IR组肾脏损伤逐渐加重,在24 h达到高值。结论:采取左肾缺血45 min,右肾摘除的方式可以建立合适的急性肾缺血再灌注损伤模型。第一部分第二节:远端缺血预处理对缺血再灌注后肾功能的保护作用比较背景:在泌尿外科手术如肾部分切除术、肾移植手术中,肾脏会面临一段缺血过程,即使血流复灌仍将导致缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury,IRI)。为减少缺血再灌注损伤,保护措施如缺血预处理(Ischemic Preconditioning,IPC)现象被发现。IPC最初运用于心血管系统的预处理来实现对心脏的保护。为了规避IPC对靶器官血管的压迫损伤,“升级版”远端缺血预处理现象(Remote Ischemic Preconditioning,RIPC)出现。RIPC能运用于心外器官,并且不同时期—即刻期RIPC(Acute Phase RIPC)和延迟期RIPC(Delayed Phase RIPC)保护作用不同。RIPC在泌尿外科领域的运用尚处于早期研究阶段,对肾功能的保护作用仍具有争议性。在对RIPC作用机制研究中,缺氧诱导因子-1(HypoxiaInducible Factor-1,HIF-1)可能参与其中。为此,本部分主要探讨RIPC对缺血再灌注后肾功能的保护作用及HIF-1在RIPC中的作用。材料与方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:1.假手术组(Sham):开腹,只分离左右两侧肾蒂,关腹;2.急性缺血再灌注组(IR):开腹,分离左右两侧肾蒂,采用微创血管夹夹闭左侧肾蒂的同时摘除右侧肾脏,夹闭45 min后,松开血管夹,恢复血液灌流,关腹。3.即刻期RIPC预处理组(Acute):予以RIPC预处理后,即刻采取同IR组措施。4.延迟期RIPC预处理组(Delayed):予以RIPC预处理24 h后,采取同IR组措施。所有分组在术后24 h时间节点分别处死并进行相应的标本收集来检测血液中的肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)和肾组织中的髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),对左肾组织行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)评估病理变化并进行肾小管评分。此外,检测HIF-1α的免疫印迹(Western Blot,WB)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)表达,以及血液中肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)的检测。结果:1.从肾功能指标Cr、BUN和氧化损伤指标MPO、MDA、SOD和肾小管评分来看,Acute、Delayed组均较IR组显著改善(P<0.05),肾脏损伤减轻,保护效果显著。2.Delayed组在BUN、MPO和肾小管评分上显著优于Acute组(P<0.05),保护效果较Acute组好。3.经RIPC预处理后,HIF-1α表达水平在Acute和Delayed组较IR组显著提高(P<0.05),且Delayed组与Acute组相比具有更高的表达(P<0.05)。延迟期RIPC可显著提高血液中肾上腺髓质素(ADM)水平(P<0.001)。结论:经肢端远端缺血预处理—3×(5I/5R)预处理模式在一定程度上为急性肾缺血再灌注损伤后肾功能提供保护作用。不同时期的远端缺血预处理对肾功能的保护作用具有统计学差异性,其中延迟期RIPC较即刻RIPC具有较好的保护作用。HIF-1和ADM可能参与RIPC的保护效应。第二部分:缺氧诱导因子-1和肾上腺髓质素在远端缺血预处理对缺血再灌注后的肾功能保护的作用机制背景:远端缺血预处理(RIPC)可为缺血再灌注后肾功能提供一定程度的保护作用。尽管目前对RIPC的作用机制尚未全部明确,现已知其包括三大通路:(1)神经通路。(2)全身系统反应通路。(3)体液通路。在体液通路中传递预处理信号至靶器官的体液因子尚未被明确。前期预实验明确了远端缺血预处理对缺血再灌注后肾功能的保护作用,且延迟期预处理的保护效果较好。此外,发现缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在远端缺血预处理后表达升高。同时,经延迟期远端缺血预处理后,血液中的肾上腺髓质素(ADM)水平也显著升高。鉴于HIF-1和ADM可能在RIPC中发挥作用,本章节主要在延迟期远端缺血预处理方案下,进一步明确HIF-1α和ADM在RIPC中的作用机制和探讨ADM是否是潜在的保护因子。材料与方法:雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组:(1)假手术组(Sham):开腹,只分离左右两侧肾蒂,关腹;(2)急性缺血再灌注组(IR):开腹,分离左右两侧肾蒂,采用微创血管夹夹闭左侧肾蒂的同时摘除右侧肾脏,夹闭45 min后,松开血管夹,恢复血液灌流,关腹。(3)延迟期RIPC预处理组(Delayed):予以RIPC预处理24 h后,采取同IR组措施。(4)YC-1干预组(YC-1):在RIPC预处理前2 h予以抑制剂YC-1药物干预,后采取同Delayed组措施。(5)DMOG干预组(DMOG):在RIPC预处理前2 h予以激动剂DMOG药物干预,后采取同Delayed组措施。(6)ADM干预处理组(ADM):在相同时间点予以ADM药物干预,后采取同IR组措施。Sham、IR和Delayed组在相同注射时间点注射空白溶媒制剂。所有分组在术后24 h时间节点分别处死并进行相应的标本收集来检测血液中的肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)和肾组织中的髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),对左肾组织行苏木精—伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining,HE)评估病理变化并进行肾小管评分。此外,检测HIF-1α的免疫印迹(Western Blot,WB)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)表达,以及血液和肾组织中肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)的检测和IHC检测。结果:1.经药物干预后的延迟期远端缺血预处理的保护效果不尽相同,与IR组相比,Delayed组和激动剂DMOG组对肾功能指标Cr和BUN的改善效果较好(P<0.01)。给予外源性ADM(ADM组),在肾功能指标上与IR组无显著差异(P>0.05)。此外ADM组对氧化损伤指标的改善能力显著低于Delayed组和DMOG组(P<0.05)。2.在采用药物干预后,各干预组缺血再灌注后的肾组织HIF-1α表达具有显著影响(P<0.05),其中Delayed组、激动剂DMOG组、抑制剂YC-1组高于ADM组(P<0.05)。3.在给予外源性ADM后,ADM组在肾组织中的ADM表达水平高于IR组(P<0.05),但低于Delayed和DMOG这两组ADM水平(P<0.05)。4.ADM组对缺血再灌注后肾脏的保护作用显著低于Delayed组(P<0.05),但较YC-1组具有较轻的肾组织病理损伤程度和评分(P<0.05)。结论:HIF-1参与RIPC的保护作用,激动或者抑制HIF-1的表达水平可相应增强或减弱RIPC的保护效应。外源性ADM对缺血再灌注后肾脏显示部分保护作用。HIF-1和ADM的表达和作用与RIPC的保护效应具有相关性,ADM在体液中的调控机制复杂,可能与HIF-1的表达具有相关性。作为RIPC过程中的一个保护因子,ADM具体的作用机制需要更深入的研究。