【摘 要】
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黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科（Labiatae）黄芩属多年生草本植物,为山西省道地中药材。黄芩含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素等多种黄酮类衍生物。近年来,国内外对黄芩的研究多集中于以黄芩为原料的中成药制作工艺、成份测定方法、生化及药理特性等研究,而对其生物合成的分子机理与代谢调控研究相对较少。本试验克隆分析黄芩中黄酮合成关键酶基因SbFNSII-
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黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科（Labiatae）黄芩属多年生草本植物,为山西省道地中药材。黄芩含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素等多种黄酮类衍生物。近年来,国内外对黄芩的研究多集中于以黄芩为原料的中成药制作工艺、成份测定方法、生化及药理特性等研究,而对其生物合成的分子机理与代谢调控研究相对较少。本试验克隆分析黄芩中黄酮合成关键酶基因SbFNSII-1、SbFNSII-2、SbCHS-2,分别构建其酵母真核表达及农杆菌表达系统并进行生物转化;优化黄芩生根、愈伤及细胞悬浮培养体系,分析愈伤组织中关键酶基因,为通过植物组织培养技术获得黄芩次生代谢产物奠定基础;测定不同物候期黄芩关键酶基因表达量和有效成分含量来研究其动态变化规律,寻找其打顶处理时间及作为饲草添加剂的可行性,以期高效利用黄芩整株资源。得到实验结果如下:1.利用高保真酶扩增获得黄芩中黄酮类化合物合成关键酶基因—SbFNSII-1、SbFNSII-2、SbCHS-2,其基因全长分别为1509、1518和1205 nt,预测发现其分别编码大小为502、505和390个氨基酸的蛋白质,且均具有相应蛋白家族的特征位点及结构域,其中SbFNSII-1、SbFNSII-2与金银花（Lonicera macranthoides）、紫苏（Perilla frutescens）亲缘关系较近,SbCHS-2与粘毛黄芩（Scutellaria viscidula）密切聚类,与金氏海藻（Genlisea aurea）亲缘关系较近。2.结合Gateway重组技术构建黄芩关键酶基因酵母真核表达系统及农杆菌表达系统。构建体外高效表达黄芩FNSII-1和CHS-2基因的真核表达载体pYES-dest52-FNSII-1及pYES-dest52-CHS-2,并将其导入酵母菌INVSc1中进行真核表达,得到表达黄芩苷生物合成前体或中间体化合物的最佳诱导条件为OD600值为0.8～1.0。构建重组质粒pK7WG2R-FNSII-2及pK7WG2R-CHS-2并将成功转化A4农杆菌,为诱导黄芩毛状根,建立黄芩活性成分离体培养体系奠定基础。3.利用植物组织培养技术对黄芩种子消毒方式及生根、愈伤、细胞悬浮培养体系进行优化,结果表明:用2%NaClO对黄芩种子消毒20 min时,其发芽势和发芽率较高,且染菌率较低;黄芩生根诱导的最佳培养基为:1/2 MS+0.5 mg/L矮壮素+0.2 mg/L NAA;黄芩愈伤诱导的最佳方法为:在MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA固体培养基中利用黄芩茎段进行诱导;黄芩细胞悬浮培养体系最佳培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.3mg/L KT。对黄芩愈伤组织关键酶基因扩增,发现黄芩愈伤中仅含有FNSII-2及CHS-2基因。4.应用qRT-PCR对不同物候期黄芩叶片中SbFNSII-1进行定量检测,结果显示SbFNSII-1在不同时期表达趋势呈“M”型变化,在展叶期盛期达到最高值。通过对不同时期打顶处理后黄芩根系中黄芩苷的测定,发现二年生和三年生黄芩黄芩苷处于较高水平,在展叶期盛期打顶处理后的黄芩植株根部黄芩苷含量均达到峰值。通过测定不同年限黄芩中粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等饲料应用指标,证明黄芩具有基本的牧草营养价值,为黄芩作为中药饲料添加剂提供了一定的理论依据。
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