论文部分内容阅读
[目的]通过对喜马拉雅大戟的蒙医功效和毒性评价,筛选具有蒙医主要功效的活性部位,并对其主要化学成分和指标性成分进行分析,为喜马拉雅大戟的蒙医临床应用提供科学依据。通过建立喜马拉雅大戟的炮制规范,阐释炮制原理,为喜马拉雅大戟饮片的临床应用和产业化提供实验数据。通过比较喜马拉雅大戟的炮制前后主要药效作用,论证其“不炮则催吐,炮则导泻”的蒙医传统功效特征和“改变药物功效而符合病情”为目的的蒙医炮制理论。[方法]采用小鼠泻下试验(排便时间和滤纸稀便痕迹法),大鼠催吐试验(异癖高岭土法),大鼠利尿试验(代谢笼法),小鼠急性毒性试验(改良寇氏法)等实验方法评价喜马拉雅大戟的泻下、催吐、利尿作用和毒性;采用煎煮、回流、萃取等提取方法,对喜马拉雅大戟的水、乙醇和石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位进行提取,并通过小鼠泻下试验(排便时间和滤纸稀便痕迹法)筛选出有效部位;采用超高效液相色谱串联质谱快速鉴定法分析鉴定喜马拉雅大戟泻下活性部位的主要化学成分,通过参考文献及药材植物性质筛选指标性成分,并建立了其含量测定的高效液相色谱法;采用炮制品传统外观、主要药效和主要活性成分总萜含量为观察指标,通过多指标加权综合分析正交试验,确定喜马拉雅大戟最佳炮制工艺条件,并建立其饮片质量标准;采用小鼠泻下试验(排便时间和滤纸稀便痕迹法)、大鼠催吐试验(异癖高岭土法)、小鼠急性毒性试验(改良寇氏法)、兔皮肤刺激性试验、兔眼刺激性试验、小鼠肠推进试验(活性炭法)等动物实验方法,结合UP-MS、BCA、PCA、OPLS-DA等分析方法和统计方法,比较喜马拉雅大戟炮制前后泻下作用、催吐作用、毒性,刺激性和对小肠运动、肠粘膜和肠组织蛋白的影响,以及化学成分变化。[结果](1)喜马拉雅大戟各剂量组小鼠开始排稀便时间和6h内稀便痕迹均有非常显著性差异(P<0.01);高剂量组大鼠异癖高岭土量有非常显著性差异(P<0.01),低剂量组则无显著性差异(P>0.05);各剂量组6h尿量无显著性差异(P>0.05);小鼠灌胃LC50为9.63±1.548/kg,其95%可信区限为8.2～11.298/kg。(2)喜马拉雅大戟醇提取物组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组小鼠开始排稀便时间和6h内稀便痕迹有非常显著性差异(P<0.01),氯仿部位组有显著性差异(P<0.05),水提取物组和正丁醇部位组无显著性差异(P>0.05)。(3)在喜马拉雅大戟石油醚部位共鉴定出了22个化合物,其中三萜类化合物3个,二萜类化合物19个;其中羊毛甾醇在0.006mg/mL～0.16mg/mL(2=0.9999)范围之内有良好的线性关系,平均回收率为101.31%,平均含量为6.王7mg/g(4)喜马拉雅大戟的最佳炮制工艺条件为药材和青稞比例为1:10,青稞温度为120℃,煨制时间为40min;饮片薄层色谱斑点清晰,分离较好,Rf=0.39;规定水分不得过8.0%,总灰分不得过7.0%,酸不溶性灰分不得过3.0%,醇溶性浸出物(热浸法)不得少于15.0%,羊毛兹醇含量不得少于3.0mg/g。(5)制喜马拉雅大戟各剂量组小鼠开始排稀便时间和6h内稀便痕迹均有非常显著性差异(P<0.01),各剂量组大鼠异癖高岭土量无显著性差异(P>0.05),其小鼠灌胃LD50为14.04±1.92g/kg,95%可信区限为12.25～16.08g/kg;与炮制前相比导泻作用减弱约10%,催吐作用显著减弱,毒性降低约45%。喜马拉雅大戟对兔正常皮肤有中度刺激性,对兔眼有强刺激性,并能够明显促进小鼠小肠内活性炭的推进率(P<0.01),同时可使小鼠小肠绒毛的融合、萎缩,肠绒毛上皮细胞的炎性渗出、空泡变性和坏死;而制喜马拉雅大戟对兔正常皮肤有轻度刺激性,对兔眼有中度刺激性,并能够促进小鼠小肠内活性炭的推进率(P<0.01或P<0.05),同时仅会引起小鼠小肠少量肠绒毛尖部上皮细胞的染色变浅。从喜马拉雅大戟生品组和炮制品组小鼠小肠提取鉴定的16种差异表达蛋白与体内13个生物过程、5个分子功能、1个所处细胞位置和Mucin type 0-glycan biosynthesis、Prion diseases、Base excision repair等3个代谢通路有密切关系。喜马拉雅大戟炮制前后有重要贡献的差异标志物主要为Geraniin、8-0-Tigloylingol、Helioscopinolide E、17-Hydroxyjolkinolide B等。[结论]喜马拉雅大戟具有显著的导泻、催吐药理活性,没有利尿作用,具有一定的毒性,属于中等毒性药物。其石油醚部位是导泻作用的主要活性部位,主要含有二萜和三萜类成分。喜马拉雅大戟青稞制炮制方法既符合蒙医传统炮制要求,也符合《中国药典》相关要求。炮制后其泻下作用明显缓和,催吐作用变为不显著与其炮制后包括强刺激性的毒性降低有关,也与因强刺激性而引发的促进小肠推进运动和小肠肠壁的肠绒毛病变、小肠肠粘膜炎性细胞渗出及以Anxa10、Dctpp1、St6galnac为主的小肠组织蛋白质有关。其物质基础是以 8-0-Tigloylingol、Helioscopinolide E、17-Hydroxyjolkinolide B为代表的萜类化合物。