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骨缺损指骨的结构完整性被破坏,是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。临床上粉碎性骨折造成的大段骨缺损一直是外科医生的一大难题,常用的办法是自体骨移植,然而,自体骨移植不仅来源有限,而且会造成取骨区疼痛、出血。近年来,骨组织工程的研究有望解决这一问题,具诱导成骨活性的生物支架材料是骨组织工程中的一大热点。另外,一些成骨生长因子或细胞因子如骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等加入支架中可以增强骨的修复率。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属于转化生长因子-β超基因家族,BMP-2是BMP家族中被研究的较早也是研究的最多的一种骨诱导生长因子,具有很强的诱导成骨的作用。研究表明,BMP-2作为骨折初始阶段的启动因子,可以诱导间充质细胞向骨细胞分化,促进成骨细胞分化成熟,参与骨和软骨的生长发育及其重建过程,进而加速骨缺损的修复。然而,作为一种蛋白质类药物,BMP-2亦具有蛋白质类药物普遍表现出的生物稳定性差、半衰期短,进入人体内后快速随体液扩散或者被降解的特性,从而不能在期待部位发挥长效作用,无法达到预期的疗效。所以,如果将BMP-2与合适的载体相结合以制备BMP-2缓释系统,就可以避免由于BMP-2半衰期短所造成的不便,发挥其良好的诱导成骨作用。近年来,使用可生物降解聚合物材料运载蛋白质,将蛋白质类药物制成微球的研究引起人们广泛的关注。生物可降解聚合物材料指的是天然或者能够通过人工合成得到的,可以在人体内通过酶解或非酶解作用降解的大分子聚合材料,其降解产物对机体无毒,且能参与机体新陈代谢或者通过正常生理途径排出体外。其中聚乳酸(PLA)由于具有良好的生物相容性、可生物可降解性、无毒性而成为常用的药物载体之一,已得到美国FDA的批准,成功应用于临床骨科及手术缝合线等领域。但因PLA中含有大量的酯键,因而其亲水性较差,为满足运载不同性质药物的要求,对PLA改性就显得尤为重要。最常见的改性方法是向PLA中引入亲水性物质聚乙二醇(PEG),PEG具有优良的生物相容性,其安全性已经得到了美国FDA的认证。PEG的引入能在提高PLA亲水性的同时赋予PLA一些新的特性和功能,它能降低生物体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的黏附,从而避免在体内被免疫系统识别;它还能保护被改性的PLA不受免疫系统的破坏,且形成的两亲性共聚物具有可修饰性,如可引入端基活性基团。本课题以BMP-2为模型药物,以可降解多聚物聚乳酸-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物(PPLA)作为载体材料,采用复乳溶剂挥发法成功制备了用于治疗骨缺损的BMP-2/PPLA缓释微球,并对所制备的微球进行了一系列的研究,主要包括BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究、BMP-2/PPLA微球的理化性质研究、BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究。1.BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究首先,建立BMP-2/PPLA微球药物含量测定方法,然后,以包封率为评价指标,对微球的处方和工艺因素进行单因素考察,找到对微球包封率影响最主要的四个因素;采用正交实验设计优化处方和工艺;选择合适的方法对BMP-2/PPLA微球进行干燥;最后,进行重现性试验,验证处方组成的合理性以及制备工艺的稳定性。结果表明,采用超速离心、考马斯亮蓝UV法测定BMP-2/PPLA微球的包封率和载药量,精密度和回收率均高、重现性好,BMP-2在5.5～49.5μg/mL浓度范围内,吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好;通过单因素及正交试验得到最优处方为PVA浓度为4%,PPLA浓度为90mg/mL,内水相、油相体积比为1:5,油相外水相体积比为1:10。微球重现性结果良好。2.BMP-2/PPLA微球的理化性质研究根据最优处方制备BMP-2/PPLA微球,通过光学显微镜及超景深显微镜观察其外观形态;通过激光粒度分析仪对所制备的BMP-2/PPLA微球的粒径、粒度分布以及Zeta电位进行研究。采用复乳溶剂挥发法制备BMP-2/PPLA微球,该法制备的BMP-2/PPLA微球在光学显微镜和超景深显微镜下观察成圆整的球形,平均粒径为(3.74±0.45)μm,Zeta 电位平均值为(-23.27±0.76)mv,包封率为(79.80±0.06)%。3.BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究首先,建立了 BMP-2/PPLA微球体外释放度的测定方法并进行了方法学考察;然后,采用动态膜透析法,以pH4.0的醋酸盐缓冲液为释放介质,以BMP-2溶液为对照,测定不同时间点BMP-2/PPLA微球的体外释药情况,绘制释放曲线,考察BMP-2/PPLA微球的体外释药规律。结果表明,所建立的BMP-2/PPLA微球含量测定方法,精密度高、准确度高、稳定性好,在0.55～llμg/mL浓度范围内,吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好,符合含量测定要求。体外释放试验结果表明,BMP-2原料在释放介质中释放较快,仅需50分钟累积释放百分率就达89.34%;BMP-2/PPLA微球制剂可长期稳定释放,3天的累积释放百分率达40%,第12天累计释放百分率达到85%,缓释效果较好。