论文部分内容阅读
目的:
随着高通量测序技术的发展，越来越多细菌中的非编码小RNA(smallnon-codingRNAs，sRNAs)被发现。这些sRNAs不编码蛋白质，而作为基因表达关键调控因子，有利于宿主-细菌之间的相互作用，并在病原体生存的转录后调控中起着关键作用。本研究旨在发现鼠疫耶尔森菌体新的sRNAs及其对毒力影响，揭示鼠疫菌在体外生长和体内感染期间相关sRNAs的表达模式，便于将来研究鼠疫耶尔森菌的sRNAs及其功能。
方法:
1.RNA测序和信息学分析:分别提取四种条件，TMH培养基、BHI培养基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾内的鼠疫耶尔森菌总RNA，回收50～500ntRNA片段，进行Solexa测序。经过生物信息学分析，筛选位于基因间区或反义链上，且存在于两个及两个以上样品的转录本，作为候选sRNAs。
2.候选sRNAs特征的证实:针对上述获得的候选sRNAs信息，设计相应的特异性引物，经体外转录制备地高辛标记的RNA探针，通过Northernblot实验检测候选sRNAs存在、大小和稳定性;通过引物延伸实验来确定这些高丰度表达sRNAs的转录起始位点。
3.候选sRNAs差异表达的证实:每个RNA样品，用特异性引物逆转录成cDNA后进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，分析比较候选sRNAs在体内外条件下差异表达情况;通过Northernblot实验检测候选sRNAs在体外条件下差异表达情况。
4.鼠疫菌sRNAs缺失突变株的构建:我们筛选部分高表达的sRNAs，采用λRed同源重组技术制备鼠疫耶尔森菌sRNAs缺失突变株。
5.表型实验和小鼠感染实验:通过观察菌落形态和体外生长，比较鼠疫菌野生株和sRNAs突变株的体外生长相关的表型变化;鼠疫菌野生株和sRNAs突变株分别接种于BHI培养基26℃培养至对数中期，37℃继续培养1hr。大约100个CFU鼠疫菌皮下注射感染6周龄的BALB/c小鼠，观察14天的死亡情况。
结果:
1.经RNA测序和数据分析，最终发现了104个鼠疫耶尔森菌的非编码sRNAs，包括26个在其他基因组中已经注释的和78个新发现的sRNAs。
2.Northernblot实验结果验证了14个新的小RNA存在，转录本长度与RNA测序得到的长度基本吻合，并对sR034等6个sRNAs的大小和稳定性进行了初步验证;引物延伸实验结果表明，成功确定了两个sRNAs(sR034和sR035)的转录起始位点，与RNA测序结果基本一致。
3.经qRT-PCR证实，发现CsrB，CsrC，4.5SRNA和sR027等4个sRNAs在感染小鼠肺脏中表达下调。
4.成功构建了sR035等9个鼠疫菌sRNAs缺失突变株。
5.表型实验证实sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈现光滑表型;小鼠毒力实验证实，已知毒力相关sRNAssrA缺失突变株的毒力减弱，其他5个sRNAs缺陷变异株没有减毒。
结论:
本研究发现了104个sRNAs，对其基本特征和体内外表达情况进行了初步鉴定。sRNAssrA是鼠疫菌经由皮下途径感染小鼠时毒力调节必需的。但是，其他检测sRNAs对毒力没有明显影响。