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目的:绒癌（choriocarcinoma CC）是一种高度恶性的肿瘤，早期即可发生血行转移，导致全身播散。虽然目前化疗效果比较好，但随着耐药病例的出现，使绒癌的治疗出现了新的困难。因此，如何提高这部分患者的治愈率及生存率是临床医生所面临的一个难题。microRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物中，长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，能通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而在转录后水平对基因的表达进行调控。它们与人类的生长发育、干细胞分化与自我更新以及肿瘤、心脏疾病、艾滋病等多种疾病关系密切，尤其在肿瘤的发生发展过程中，扮演着重要角色。miR-34最先发现于线虫，并在一些非脊椎动物中保持同源性，是一类保守的、非编码miRNA。人类miR-34包括miR-34a、miR-34b和miR-34c等，基因结构的预测结果表明：成熟mir-34a序列位于其主基因原初转录本外显子1下游约30kb的外显子2内；成熟mir-34b序列位于该基因原始转录本的内含子1内；mir-34c序列位于同一主基因原初转录本的外显子2内。根据miRBase序列数据库及ensembl数据库资料显示：has-mir-34a定位于1p36.23，其茎环结构序列位于1号染色体第9、134、314位至第9、134、423位负链上，共计110个核甘酸序列；has-mir-34b和has-mir-34c共同位于11q23.1，前者茎环结构序列位于11号染色体第110、888、873位至第110、888、956位正链，共计84个核苷酸序列；后者茎环结构序列位于该染色体第110、889、374位至第110、889、450位正链，共计77个核苷酸序列。miR34在多种肿瘤中都呈现非正常表达。miR-34通过被p53激活，抑制E2F3、Bcl-2、c-myc、CDK4、CDK6、Cyclin D1以及CyclinE2的表达，使肿瘤细胞停滞在G1期，抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，并通过E2F3、SIRT1与p53形成正反馈环路，不断增强其自身和p53的作用。最近研究证实，miR34能够在多种肿瘤细胞中表达：人类结肠癌的发展过程中miR34a的表达下调，在胰腺癌肿瘤细胞和儿童神经母细胞瘤（neuroblastoma）中miR34a的表达经常缺失；同时人为提高miR34a的表达能够抑制细胞增殖并激活细胞凋亡途径。这些研究表明miR34a表达的下调或缺失与肿瘤的发生和细胞增殖之间存在着联系，miR34a的表达对抑制细胞增殖，激活细胞凋亡途径有重要意义。ValeryTarasovl等研究证实，miR34a是P53基因的直接靶标之一，染色体免疫沉淀反应和荧光素酶分析证实P53基因活化miR34基因转录，miR34家族的miRNA可以和P53的其它靶标，如P21和BAX一起，在可促使恶性肿瘤发生的应激条件下促进细胞生长停滞和死亡的发生。P53基因做为一种细胞增殖负调节因子,调控细胞的生长和分化,维持基因组DNA的稳定,其突变或缺失所致的P53失功能可能在肿瘤发生、发展中起着重要的作用。研究发现P53基因与滋养细胞肿瘤的生物学行为有密切关系。P53基因的表达与葡萄胎滋养细胞的增生程度有关，并且P53的细胞凋亡调控水平失衡对于葡萄胎由良性转变为恶性起了重要作用。同时研究发现，在MCF-7细胞系中加入能够激活p53基因的依托泊苷（etoposide）能够诱发大小约为3.7kb的mir-34a原初转录本（pri-mir-34a）的表达。因此，本实验通过应用依托泊苷作用于人绒毛膜癌细胞株JEG-3，以期上调microRNA34a （miR34a）在人绒毛膜癌细胞株JEG-3中的表达，同时观察不同药物作用时间内miR34a表达情况，并检测不同时间JEG-3绒癌细胞增殖和凋亡的情况，探讨miR34a在绒癌发生发展过程中的作用，为绒癌的诊断和基因治疗提供理论依据。方法:1.用含15%胎牛血清的RPMI-1640培养JEG-3细胞，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。2.利用临床应用化疗药依托泊苷体外上调人绒毛膜癌JEG-3细胞中miR34a表达，将培养细胞分为：对照组（常规培养，未进行任何处理）、加药6小时、12小时、24小时和48小时组。3.倒置显微镜下观察细胞形态学变化。4.一步法Trizol提取细胞中总RNA，实时定量PCR方法检测各组细胞miR34a表达情况，实验重复三次。5.四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖能力，实验设4个平行复孔。6.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，实验重复三次。7.采用SPSS13.0统计软件对所有数据进行统计学分析。数据以均数±标准差（x±S）表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较正态、方差齐采用单因素方差分析，非正态或方差不齐采用秩检验，p>0.05为无显著性差异，p<0.05为具有显著性差异，所有实验均重复3次。结果:1.绒毛膜癌JEG-3细胞用含有15%（体积分数）胎牛血清的1640培养基，在37℃、5%（体积分数）CO2培养箱中培养。其生长状态良好，细胞贴壁生长、椭圆形或圆形、排列紧密、大小均匀、边界清楚、细胞膜完整，细胞核界限清晰，胞浆中可见黑色分泌颗粒。2.用药6-24小时，部分贴壁细胞死亡，漂浮于培养液中，剩余细胞形态尚好，用药48小时，大部分贴壁细胞死亡，漂浮于培养液中，剩余细胞形态渐不规则，细胞大小不等，有的细胞可有长的伪足，胞浆中黑色颗粒增多。3.绒毛膜癌JEG-3细胞中有miR34a表达。将对照组miR34a表达水平作为1，使用依托泊苷作用6小时、12小时、24小时miR34a表达水平分别为1.378±0.511，1.667±0.982，1.742±0.405，较对照组分别上调37.8%，66.7%，74.2%，但与对照组比较差异无明显统计学意义（P＞0.05）；48小时miR34a表达水平为5.423±3.611，较对照组上调442.3%，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。4.MTT法检测各组细胞增殖能力：6小时下降16.97%,12小时下降42.56%，24小时下降49.00%，48小时下降70.57%，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。5.流式细胞术检测细胞凋亡率：6小时增加4.92倍，12小时增加7.46倍，24小时增加8.76倍，48小时增加9.23倍，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:人绒毛膜癌细胞株JEG-3中有microRNA34a的表达；依托泊苷可诱导microRNA34a高表达，随作用时间的延长上调明显；microRNA34a可能有降低细胞的增殖能力的作用，但microRNA34a表达量与细胞增值率两者变化不同步，考虑microRNA34a只是导致细胞增殖能力下降的原因之一；microRNA34a可能有激活细胞凋亡途径的作用，但microRNA34a表达量与细胞凋亡率两者变化不同步，考虑microRNA34a只是影响细胞凋亡的原因之一；microRNA34a可能对绒癌的发生发展起抑制作用。