目的:基于酿酒酵母表面展示技术构建COVID-19口服候选疫苗,并对其诱发的免疫应答进行分析。方法:以SARS-Co V-2的S基因（基因库编号:MN908947）为模板,经PCR扩增获得的目的基因RBD。利用NheⅠ/Eco RⅠ对RBD基因和表达质粒p YD1进行双酶切,通过T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒p YD1-RBD。将p YD1-RBD转化至感受态E.coli DH5α,经PCR、双酶切分析以及测序鉴定,获得阳性克隆E.coli DH5α/p YD1-RBD。进一步地,从E.coli DH5α/p YD1-RBD提取重组质粒p YD1-RBD,并转化至感受态酿酒酵母EBY100,通过色氨酸营养缺陷型（Trp-）培养基筛选,经PCR和测序获得阳性克隆EBY100/p YD1-RBD。以半乳糖作为诱导剂,通过Western blot、免疫荧光显微镜以及流式细胞仪对诱导表达72 h后的EBY100/p YD1-RBD进行体外表达分析。以SPF级BALB/c小鼠作为口服免疫动物模型,考察EBY100/p YD1-RBD诱发的免疫应答水平。通过ELISA检测口服免疫后小鼠的体液免疫应答、黏膜免疫应答和细胞免疫应答水平。通过SARS-Co V-2假病毒检测免疫后小鼠中和效价。结果:通过常规的分子生物学方法,成功地构建了EBY100/p YD1-RBD。通过Western blot对EBY100/p YD1-RBD表达的特异性RBD蛋白进行分析,其蛋白分子量约为32 k Da。通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪对RBD蛋白的表达位置和表达效率进行分析,RBD蛋白定位表达在酿酒酵母EBY100的表面,表达效率约为45.1%。BALB/c小鼠口服免疫EBY100/p YD1-RBD后可产生特异性血清Ig G和分泌型Ig A。进一步地,通过流式细胞仪分析了细胞因子的表达水平,CD4+T和CD8+T细胞介导的IFN-γ的分泌水平高于IL-4的分泌水平,这表明EBY100/p YD1-RBD能够诱导有意义的细胞免疫应答以及混合型Th1/Th2反应,并具有Th1偏向性。微量中和分析结果表明免疫后小鼠能够产生有意义的中和抗体。结论:酿酒酵母表面展示系统为开发更多安全、有效的COVID-19口服候选疫苗提供了可靠的技术支撑,这也为开发其他烈性传染病毒或细菌口服疫苗提供新的研究思路和策略。