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研究背景和目的卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中致命率最高。PARP抑制剂是新型抗肿瘤药,适用于BRCA基因突变患者。随访发现几乎所有患者最终产生耐药和肿瘤进展。明确耐药机制并克服,提高PARP抑制剂治疗效果成为卵巢癌研究热点。乙醛脱氢酶(ALDH)活性常与肿瘤多重耐药性相关,目前尚未有研究明确ALDH是否也参与介导卵巢肿瘤细胞对PARP抑制剂的耐药性。本课题通过研究ALDH家族中ALDH1A1基因是否参与介导PARP抑制剂耐药性及可能机制,探讨逆转耐药可能性,为发现临床耐药卵巢肿瘤治疗新靶点提供线索及思路。研究方法1.BRCA2-/-PARP抑制剂耐药细胞的构建及验证;2.流式细胞仪检测耐药株与亲本细胞ALDH酶活性差别;3.亚甲蓝细胞染色法检测ALDH酶活性与PARP抑制剂耐药性关系;4.RT-PCR检测ALDH家族各基因表达选定靶基因ALDH1A1,分别用质粒、siRNA调控ALDH1A1,检测对细胞耐药性的影响;5.免疫印迹实验检测PARP抑制剂对ALDH1A1上游蛋白BRD4的作用及调控BRD4对ALDH1A1的功能学影响;6.上调三种DNA损伤修复通路指示细胞ALDH1A1表达并用流式细胞术测定其通路活性改变;7.亚甲蓝染色法测定ALDH1A1靶向抑制剂是否能逆转PARP抑制剂耐药性。8.小鼠体内荷瘤模型对相关机制进行验证。研究结果1.筛选出对PARP抑制剂稳定耐药的PEO1-R,Kura-R细胞;2.耐药株ALDH酶活性明显较亲本细胞高(P<0.01),且升高是PARP抑制剂直接诱导导致的;3.ALDH酶活性升高,细胞对PARP抑制剂的耐受性升高(P<0.01)4.RT-PCR提示ALDH1A1为主要作用基因,过表达ALDH1A1细胞耐药性升高(P<0.01),同样下调ALDH1A1则细胞敏感性升高(P<0.01);5.PARP抑制剂可以正向调控BRD4;若抑制BRD4功能,ALDH1A1不再受PARP抑制剂诱导;6.过表达ALDH1A1,细胞DNA修复能力明显增强,且同源重组途径或非同源末端连接途径活性无显著性差异(P>0.05),只有微同源末端连接途径明显增强(P<0.01);7.联合应用PARP抑制剂奥拉帕尼及ALDH1A1特异性抑制剂后,在BRCA2野生型细胞中细胞存活率差异较单药组无显著性差异(P>0.05),而在BRCA2-/-细胞中可见显著药物协同作用(P<0.01)。8.小鼠体内实验同样显示联合用药组对肿瘤杀伤作用最明显(P<0.01)。研究结论1.PARP抑制剂本身可诱导ALDH1A1表达的增强,从而导致ALDH酶活性的增强;2.这种诱导是通过正向调控BRD4达成的;3.ALDH1A1在BRCA2-/-的卵巢肿瘤细胞内,可通过增强其微同源末端连接修复能力促进其修复DNA损伤,从而产生药物耐受性;4.当我们使用选择性ALDH1A1抑制剂时,原耐药细胞可恢复对PARP抑制剂的敏感性;综上,本实验结果提示我们:ALDH1A1通过影响细胞DNA修复能力介导BRCA2-/-卵巢癌患者对PARP抑制剂耐受,若我们靶向抑制ALDH1A1可能逆转这一耐药性,这一机制可为ALDH1A1成为临床治疗新靶点之一提供线索,但仍需进一步实验验证。