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原癌基因Bmi1基因属于Polycomb家族成员之一。Bmi1不仅具有阻抑子功能,能够抑制细胞周素依赖性激酶抑制因子(CDKI)p16和p19,还能调节线粒体的功能,维持机体氧化还原平衡。近年来有报道指出Bmi1基因敲除小鼠呈现成熟前骨质疏松表型,但是确切的机制尚不清楚。我们前期研究结果发现,Bmi1敲除小鼠骨组织中p16基因及蛋白表达水平和ROS水平明显增加。为了明确Bmi1缺失是否通过上调p16衰老信号,引起骨骼生长发育阻滞,成骨性骨形成减少,骨髓间充质干细胞的自我更新和增殖能力下降,导致衰老性骨质疏松表型,我们建立了 Bmi1及p16双基因缺失(Bmi1-/-p16-/-)小鼠模型,通过组织病理学、细胞及分子生物学等方法,比较分析它们与Bmi1基因缺失(Bmi1-/-)小鼠、p16基因缺失(p16-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠骨骼表型的差异。结果显示,与WT小鼠相比,p16-/-小鼠骨形成各项指标包括体型、长骨长度、骨密度、骨容量、软骨生长板宽度、成骨细胞数、总胶原染色阳性比、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)阳性面积、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen,COL-I)阳性面积、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)阳性面积和成骨细胞分化的基因产物核蛋白结合因子a1(cbfa1)蛋白表达水平均明显增加,而Bmi1-/-Bmi1-/-p16-/-小鼠明显减少;与Bmi1-/-小鼠相比,Bmi1-/-p16-/-小鼠上述指标均明显增加。与上述骨形成结果相反,与WT小鼠相比,Bmi1-/-小鼠成脂相关指标骨髓中脂肪细胞数和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)蛋白表达水平,以及骨吸收相关指标抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞面和RANKL基因表达水平明显增加;与Bmi1-/-小鼠相比,在Bmi1-/-p16-/-小鼠上述成脂相关指标明显降低。这些结果表明,p16基因敲除能够通过促进成骨细胞骨形成,抑制脂肪细胞形成和破骨细胞骨吸收,发挥改善Bmi1缺失引起的骨质疏松的作用。为了明确p16基因敲除能否通过促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨分化,抑制其凋亡,发挥改善Bmi1缺失引起的骨发生障碍,我们培养了 WT,p16-/-,Bmi1-/-和Bmi1-/-p16-/-小鼠的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),通过细胞化学染色和CCK8细胞增殖实验,观察了 BM-MSC增殖、分化和凋亡的变化。结果显示,与WT小鼠相比,p 16-/-小鼠BM-MSCs的成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)、ALP阳性面积和细胞增殖明显增加,而Bmi-/-小鼠和Bmi1-/-p16-/-小鼠明显减少;与Bmi1-/-小鼠相比,Bmi1-/-p16-/-小鼠上述指标明显增加。AnnexinV/PI双染凋亡检测结果显示,与Bmi-/-小鼠相比,Bmi1-/-p16-/-小鼠BM-MSCs凋亡细胞比例明显减少。这些结果表明,p16基因敲除能够通过促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化,抑制其凋亡,发挥纠正Bmi1基因缺失引起的骨发生障碍。为了明确Bmi1缺失是否通过引起骨组织氧化应激和DNA损伤增加,导致衰老性骨质疏松表型,我们通过饮水给予3周龄Bmi1缺失小鼠补充抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,1mg/ml)两周,以正常饮水的同窝WT和Bmi1-/-小鼠作为对照,利用组织病理学、细胞及分子生物学等方法,比较分析它们与正常饮食Bmi1缺失小鼠和野生型小鼠骨骼表型的差异。通过上述成骨、成脂和破骨相关指标检测,并观察上述BM-MSCs增殖、分化和凋亡改变,结果显示NAC补充能明显改善Bmi1基因缺失引起的骨骼生长阻滞和骨质疏松表型。这些结果表明Bmi1也能通过抑制氧化应激,发挥预防骨质疏松的作用。本研究揭示了 Bmi1通过抑制p16衰老信号和氧化应激,发挥预防骨质疏松的作用及机制,从而为骨质疏松防治提供了新的理论和新的靶标。