第一部分骨髓间充质干细胞的体外提取,分离和培养,细胞鉴定目的:探索一种有效简便的提取大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并对BMSCs进行分离和培养,为后续实验提供足够的种子细胞。方法:1.选3周龄SD大鼠(雄性,清洁级),采取全骨髓贴壁分离法提取大鼠股骨及胫骨骨髓细胞,再通过纯化和连续传代培养的方法扩增得到一定数量的骨髓间充质干细胞。2.培养过程中通过光镜间断观察所提细胞的形态,大小,密度及状态变化,利用流式细胞技术检测骨髓间充质干细胞表达的特异性分子标志以鉴定所提取的细胞为骨髓间充质干细胞。3.运用免疫荧光染色技术观察细胞内干细胞相关标志物Oct4,Klf4的表达情况。结果:1.取材72h后见细胞贴壁生长,并牢固粘附于培养瓶底,细胞形态呈梭形,伪足多样化,整体呈现簇状集落式生长,7-10天后细胞胞体进一步狭长,出现典型的“成纤维细胞化”,呈波浪状;2.流式细胞术检测所提取细胞表面抗原CD44、CD90、CD31、CD45 阳性率分别为 84.95%、88.49%,0.01%,4.22%;3.运用免疫荧光染色证实细胞内干细胞相关标志物Oct4,Klf4的呈强阳性表达,联合流式细胞术结果证明所提取细胞符合干细胞特性。结论:全骨髓贴壁分离法简单易行,所获细胞能稳定传代,扩增数量能满足后续实验要求,是一种简便可靠的筛选提取方法。此方法获取的BMSCs生长情况良好,状态均一,高表达干细胞相关标志物,具有可靠的定向分化能力,能为后续的实验提供较为稳定的组织工程种子细胞来源。第二部分 骨髓间充质干细胞在无诱导因子的甲壳累纳米纤维水凝胶中定向分化为皮肤缺损修复相关细胞的研究目的:将甲壳素水凝胶作为生物材料,运用有别于传统化学交联方法的物理成胶方式将BMSCs包裹其中,从体外与体内两方面探讨和研究BMSCs包裹在该水凝胶中及移植后的生物学行为。方法:利用一种有别于传统化学交联的新方法在常温下制备甲壳素纳米纤维水凝胶,并将转染了 GFP(绿色荧光蛋白)的大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs)包裹于水凝胶中,在不加入水溶性细胞分化诱导因子的条件下,通过分子生物学技术观察BMSCs的多能分化性标记(Oct4和Klf4)在三维培养中的变化,以及皮肤缺损修复代表性细胞:血管内皮细胞,血管平滑肌细胞及成纤维细胞的特异性标志的表达;建立大鼠背部全层皮肤缺损创面模型,观察包裹大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs)的甲壳素纳米纤维水凝胶对大鼠创面的治疗作用,并通过组织病理学,免疫组化染色,免疫荧光染色及分子生物学技术评价其治疗效果。结果:1.成功运用物理成胶的方法构建凝胶状甲壳素纳米纤维水凝胶,适合用于修复伤口创面。2.成功将转染了 GFP(绿色荧光蛋白)的大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs)包裹于水凝胶中,扫描电镜显示BMSCs在甲壳素纳米纤维水凝胶中呈现典型三维生长方式;通过钙黄绿素/碘化丙啶进行死/活细胞染色发现活细胞比例超过了 86%,Transwell试验结果显示,绝大部分的BMSCs(78.4%±2.39)从水凝胶中迁徙至半透膜背面,且BMSCs在甲壳素纳米纤维水凝胶中三维生长的代谢活性有较稳定地增加。3.RT-PCR的结果显示,将转染了GFP-BMSCs包裹于水凝胶三维培养三天以后,BMSCs的干细胞相关分子Oct4,Klf4表达水平相比普通2D培养有相应下降(0.386±0.079,0.575±0.063,倍比数,P<0.001),证明BMSCs发生了相应的分化行为,一定比例的干细胞分化成为体细胞。Western blotting和免疫荧光染色的结果与RT-PCR—致。4.Westen blotting结果显示,三维培养下,成纤维细胞,血管内皮细胞及血管平滑肌细胞三种细胞相关蛋白表达水平如下:FSP-1(0.374 ± 0.171,p>0.05),collagen I(0.43 ± 0.104,p>0.05),collagen 111(0.539 ± 0.105,p>0.05),HSP47(0.639± 0.111,p>0.05),VEGF(0.56 ± 0.104,p>0.05),CD31(0.873 ± 0.122,p>0.05)and α-SMA(0.643 ±0.152,p>0.05),较2D培养(加入水溶性细胞分化诱导因子)差异无统计学意义。与此类似的是,RT-PCR和免疫荧光染色均证实了上述结果。5.各组大鼠手术建模后第十六天,BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶组大鼠伤口创面愈合率为2.950 ±2.718%,远远优于单纯水凝胶组19.637±2.841%,单纯细胞注射组25.897±3.933%,和假手术组41.117 ±3.123%,差异有显著统计学意义(p<0.01)。组织病理学(H&E染色,Masson三色染色法和天狼星红苦味酸染色)观察伤口情况显示,在第14天,BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠伤口创面显示出生长良好的肉芽组织,以丰富的血管组织及周围的胶原纤维为标志,且胶原排列整齐,叠加有序。此外,术后第16天,HE染色显示BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠伤口创面可观察到明显的血管化再生现象,其中每高倍镜视野下的血管数目达到了 17.42±1.31个,远远高于假手术组的3.00±1.13个(p<0.001)。免疫组化染色观察显示BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠在术后第7天出现了大量的新生血管,48.81±1.57个/mm2,与假手术组的8.63±1.77个/mm2相比差异有显著统计学意义(p<0.001),CD31和α-SMA双染共定位免疫荧光染色结果显示,BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠在术后第14天的创面成熟血管计数要明显高于假手术组(23.51±2.16 vessels/mm2 vs 3.64±1.14 vessels/mm2,p<0.001)。术后第7,11,16天,BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠伤口创面修复相关指标(CD31,VEGF,α-SMA)的蛋白表达水平及mRNA水平均明显高于假手术组(p<0.001)。此外,免疫荧光染色结果显示BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠创面上述指标呈强阳性表达。不仅如此,对BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠创面行促创面血管化相关因子MCP-1和PDGF的mRNA水平检测,其结果亦明显高于其余三组(p<0.001)。6.荧光显微镜显示术后各时间点BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠创面干细胞的数量在术后第7和第16天均明显高于单纯细胞注射组。进一步研究显示,在BMSCs/甲壳素纳米纤维水凝胶移植大鼠的创面中,术后第16天,表达血管内皮细胞标志物CD31的干细胞占总数的27.6 ±4.8%,表达血管平滑肌细胞标志物α-SMA的干细胞占总数的14.7 ± 2.9%,表达成纤维细胞标志物HSP47和FSP-1的干细胞占总数的44.7±6.4%。而在单纯干细胞注射组,术后第7天和16天均未发现明显发生分化的干细胞。结论:我们通过一系列体内外实验证实,将BMSCs包裹于甲壳素纳米纤维水凝胶中,能够提高干细胞活性,发挥其再生特性,促进其定向分化,加速肉芽组织重建和再生,最终促进伤口愈合。最重要的是,本研究证明了在无诱导性细胞因子的存在下,将BMSCs包裹于甲壳素纳米纤维水凝胶中后能够诱导前者定向分化为皮肤修复相关的关键细胞,从而为临床上BMSCs与生物材料在组织工程中的联合应用提供了新的思路。第三部分NPWT联合BMSCs修复大面积皮肤缺损并增强干细胞促血管生成能力的实验研究目的:我们通过体外及体内实验探讨负压真空抽吸创面治疗(NPWT)作用下BMSCs的生物活性以及分化行为,同时探讨这种联合应用方法是否能够促进创面修复以及创面血管化再生。方法:体外生物反应器构建负压真空吸引环境并培养BMSCs,观察BMSCs在负压作用下和常规培养中的形态,活力及增殖特性的变化,CCK-8法检测BMSCs在负压作用下的代谢活性,死/活细胞荧光染色观察BMSCs在负压作用下的活力;制备SD大鼠全层皮肤缺损动物模型,观察大鼠骨髓间充质干细胞联合NPWT对大鼠创面的治疗作用,并通过组织病理学,免疫组化染色,免疫荧光染色及分子生物学技术评价其治疗效果。结果:1.鬼笔环肽染色显示BMSCs在NPWT作用下呈现纺锤样生长,胞体细长呈梭形,伪足充分伸展。通过钙黄绿素/碘化丙啶进行死/活细胞染色发现,在NPWT作用下培养9天以后,BMSCs中活细胞比例超过了 76%。更有意义的是,BMSCs在NPWT作用下其增殖能力有较稳定地增加,为后续整体水平动物实验奠定了基础。2.Western blotting结果显示,NPWT作用9天后,BMSCs的相关蛋白表达水平如下:NG2(0.3767 ± 0.0328,<0.001),VEGF(0.7020 ±0.0344,p<0.001),CD31(0.8663 ± 0.0352,p<0.001),以及α-SMA(0.8211±0.0351,p<0.001),与普通无负压培养组相比差异有显著统计学意义。与此类似的是,RT-PCR和免疫荧光染色均证实了上述结果。3.动物实验发现,术后第9天,BMSCs/NPWT组大鼠伤口创面愈合率为37.15 ± 2.37%,远优于假手术组80.07±3.16%.,差异有显著统计学意义(p<0.001)。组织病理学方法(H&E染色,Masson三色染色法和天狼星红苦味酸染色)观察伤口情况显示,在第6天,BMSCs/NPWT组大鼠伤口创面有大量生长良好的肉芽组织,可见丰富的血管组织再生伴有整齐排列的胶原纤维沉积。4.BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠在术后第9天出现了大量的新生血管,51.26 ±1.644个/mm2,与假手术组的9.533 ±1.752个/mm2相比差异有显著统计学意义(p<0.001)。免疫组化染色显示BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠在术后第9天出现了丰富的Ⅳ型胶原沉积,而假手术组则十分稀少。CD31和α-SMA双染共定位免疫荧光染色结果显示,BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠在术后第9天的创面成熟血管计数要明显高于假手术组(26.433±2.741个/mm2 vs 3.530±1.741个/mm2,/<0.001)。作为创面血管化的始动因子,BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠创面TGF-β1的含量在各时间点均高于其余三组(p<0.001)。进一步运用分子生物学的方法观察发现术后第6及第9天,BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠伤口创面血管化相关指标(NG2,CD31,VEGF,α-SMA)的蛋白表达水平及mRNA水平均明显高于假手术组(p<0.001)。此外,免疫荧光染色结果显示BMSCs/NPWT联合治疗后大鼠创面上述指标呈强阳性表达。结论:本部分研究结果证明NPWT可在增强BMSC的活性,提升后者的促血管生成能力,诱导BMSC定向分化为皮肤软组织修复关键性细胞,从而加速伤口创面愈合。此联合疗法优于单独应用BMSC移植或NPWT疗法,因此,将NPWT和BMSCs联合应用在临床上是可行且有效的。本研究结果为临床医师在治疗慢性难愈性创面的患者时提供了新的治疗思路,具有十分重要的临床意义。