论文部分内容阅读
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，而目前的传统治疗方法虽有一定疗效，但却十分有限。生物治疗的研究给肿瘤治疗带来了新的希望，特别是肿瘤疫苗的研制更成为目前肿瘤治疗研究的热点之一。现有的比较受到关注的制备肿瘤疫苗的方法有各种细胞因子、共刺激分子、肿瘤抗原肽等基因修饰的肿瘤细胞疫苗；体外抗原致敏的或肿瘤抗原肽基因修饰的树突状细胞疫苗；肿瘤细胞与抗原递呈细胞融合疫苗等。这些肿瘤疫苗的制备机理均在于提高对肿瘤抗原的递呈作用。缺点是制备工艺复杂、效果相对不够理想。 Exosomes是由多种细胞分泌的来源于多囊泡体的小的膜性囊泡。肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞(DC)和肿瘤细胞均可分泌Exosomes。其中，最受到关注的是肿瘤细胞来源的Exosomes。其含有MHC Ⅰ类分子和LAMP-1，能够将肿瘤抗原呈递给抗原递呈细胞，产生显著的CD8~+T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应。提示肿瘤细胞来源的Exosomes可作为一种新型高效的肿瘤疫苗用于肿瘤的免疫治疗。的确，由于Exosomes具有非细胞结构、未经基因修饰和外源基因导入、对机体潜在危害作用小、制备简单易行等优点受到大家的重视，成为研究新型肿瘤生物治疗制剂和肿瘤疫苗的新方向。 热休克蛋白是一大类具有免疫佐剂效应的分子伴侣，主要诱导机体产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞、Th1型免疫应答并提高肿瘤细咆的免疫原性。已有的实验证实热休克作用可诱导热休克蛋白的表达，促进肿瘤细胞产生大量的趋浙江大学博士学位论文肿瘤学化因子，募集DC在肿瘤局部浸润，并由内源性携带肿瘤抗原的佐剂样分子将抗原有效地递呈，从而诱发机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。 本课题应用A20肿瘤细胞，经热休克作用，制备热休克肿瘤细胞来源的Exosomes。通过研究其蛋白组成、生物学活性和免疫学功能及其抗肿瘤效果，探讨相关的免疫学机理，希冀为具有抗肿瘤作用的新型高效的肿瘤疫苗的研制提供新思路。第一部分热休克肿瘤细胞来源的Exosomes的制备及相关生物学性 质、免疫学功能研究目的:建立热休克肿瘤细胞来源ExosomeS的制备体系，并对热休克肿瘤细胞来源Exosomes进行形态学鉴定;检测热休克肿瘤细胞来源ExoS0meS包含的蛋白组分:研究热休克肿瘤细胞来源ExosomeS的生物学特性和免疫学功能;比较热休克肿瘤细胞来源Exosomes与正常培养肿瘤细胞来源ExosomeS在蛋白组成、生物学活性和免疫学功能上的异同。方法:我们选用了小鼠B淋巴瘤细胞系A20肿瘤细胞来建立热休克肿瘤细胞来源Exosomes的制备体系。热休克条件为430C热休克(水浴)1h后，置于37℃二氧化碳孵箱恢复4h，收取培养上清。经过经典四步离心，即4℃离心300 9 x10分钟;l，200 9 X 30分钟;10，0009 x 30分钟;超速离心100，000 gx 60分钟后分离纯化得到Exosomes。通过透射电镜观察热休克A20肿瘤细胞来源ExosomeS (Heat shoek exosomes，HS一Exo)和正常培养AZO肿瘤细胞来源Exosomes(Exo)的形态，经SDS一以GE电泳分析Exo和HS一Exo的蛋白带型组成以鉴定肿瘤细胞来源ExosomeS。利用Western blot方法检测A20肿瘤细胞来源Exo和HS一Exo中含有的免疫分子情况;利用ELISA方法检测A20肿瘤细胞来源Exo和HS一Exo含有的趋化因子和其它细胞因子。 在研究A20肿瘤细胞来源Exo和HS一Exo对DC细胞的免疫作用中，利用FACS技术检测DC细胞表面相对特异性标志分子和OVA一FITC的内吞情况以观察经Exo浙江大学博士学位论文肿瘤学和HS一Exo处理48h的DC的成熟状态;用ELISA检测经Exo和HS一Exo处理的DC细胞培养上清中的前炎性细胞因子和趋化因子的分泌情况;进行混合淋巴细胞反应(MLR)实验观察HS一Exo影响DC细胞免疫刺激效应的作用;通过制备A20肿瘤细胞抗原致敏CD4+T细胞，以A20肿瘤细胞来源EXo和HS一EX。处理DC细胞，检测抗原致敏CD4+T细胞增殖情况和分泌工FN一Y的水平，研究ExosomeS处理后DC细胞的抗原递呈功能和刺激抗原特异性T细胞活化的作用。采用JH一TdR掺入法，以ExosomeS处理小鼠脾脏T细胞，观察AZO肿瘤细胞来源Exo和flS一Ex。对同种异体小鼠脾脏T细胞的增殖作用。结果:建立了热休克肿瘤细胞来源ExosomeS的制备体系，稳定有效地分离得到ExosomeS。在整体蛋白带型上我们发现分离产物与A20细胞的总蛋白提取物和胞浆蛋白的带型不同。在透射电镜下HS一Exo形态与Exo类似，呈50一SOnm的双层膜囊泡样结构，大小比较均一，结构完整。 蛋白检测发现来源于正常培养A20细胞的Exosomes和来源于热休克A20细胞的ExosomeS中均含有MHCI类分子、LAMP和HSC7O等肿瘤细胞来源ExosomeS的特征蛋白。而且HS一Ex。中的MHCI类分子含量高于Exo。在涉及抗原递呈的免疫分子中，HS一Exo含有的MHC 11类分子和CD86分子含量显著高于Exo;HS一Exo含有的CD4O分子在Exo中未检测到;两者均未检测到CD80分子。热休克诱导细胞表达热休克蛋白，对Exosomes中热休克蛋白的检测发现，在Exo和HS一Exo中均存在HSP60、HSP70和HSP90，其中HS一Exo中HSP6O和HSP90的含量显著高于Exo，HSP70的?