棉铃虫Helicoverpa armigera Hubner属鳞翅目夜蛾科实夜蛾属,是世界棉花主产区的一种重要害虫,对棉花生产造成重大损失。从上世纪80年代开始棉铃虫对多种常用化学杀虫剂产生了抗性,其中对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性尤为严重。从1997年开始转Bt基因抗虫棉在我国大面积种植,棉铃虫的为害得到了有效的控制,但棉盲蝽、烟粉虱等原来棉田的次要害虫逐渐变成了棉田的主要害虫,棉蚜和棉红蜘蛛仍在田间为害；再加上转Bt基因抗虫棉的靶标害虫种类较单一,其后期对棉铃虫的控制作用有限,因此在棉田化学防治仍然是重要的害虫控制手段之一。本文开展了不同棉区棉铃虫种群对氰戊菊酯和辛硫磷的抗性监测,以便了解在Bt转基因抗虫棉种植15年后各棉区棉铃虫对这两类药剂的抗性现状。同时进行了棉铃虫对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)的敏感性调查。利用氰戊菊酯筛选获得的安阳棉铃虫抗性品系,进行了交互抗性、抗性遗传方式和抗性机理的研究。上述工作的开展,可以为我国各棉区转基因抗虫棉广泛种植情况下棉铃虫的高效和可持续防控提供指导。具体研究结果如下：1.棉铃虫对三种化学杀虫剂的抗性监测采用点滴法测定了2011年采自华北、长江流域以及新疆棉区的13个棉铃虫田间种群对氰戊菊酯和辛硫磷的抗性水平。与室内敏感种群(SCD)相比,华北棉区和湖北潜江的棉铃虫种群对氰戊菊酯具有极高水平抗性(149-1219倍)；江苏盐城种群对氰戊菊酯为高水平抗性(44倍)；新疆沙湾和莎车种群对氰戊菊酯为低水平抗性(3-10倍)。各个监测种群对辛硫磷均表现出低水平抗性或者敏感性下降,抗性倍数为1-9倍。对甲维盐的敏感性调查表明,13个田间种群对甲维盐的LD50值变异范围小于2倍(0.00063～0.00133μg/头),明显低于室内敏感品系的LD50值(0.0074μg/头)。将三种杀虫剂对各地棉铃虫的毒力进行两两对应的相关性分析及显著性测验,结果表明甲维盐、氰戊菊酯和辛硫磷两两之间均不存在明显的交互抗性。增效剂PBO和DEF在不同棉铃虫种群中对氰戊菊酯(0.08μg/头)和辛硫磷(0.4μg/头)区分剂量的增效作用研究显示,PBO对氰戊菊酯的增效作用比较明显,用增效剂处理前存活率为64%-100%,而增效剂处理后存活率减低到0%-48%；另外一种增效剂DEF则对辛硫磷的增效作用比较明显,用增效剂处理前存活率为2%-70%,而增效剂处理后存活率降低到0%～10%。该结果表明,氧化解毒代谢增强是棉铃虫田间种群对氰戊菊酯抗性的重要机理,而酯酶解毒作用增强是棉铃虫田间种群对辛硫磷抗性的重要机理。2.棉铃虫对氰戊菊酯抗性品系的选育、交互抗性及抗性遗传方式分析在室内用氰戊菊酯对2009年9月采自河南安阳的棉铃虫种群(AY)连续筛选七代,得到氰戊菊酯高抗品系AY-FenR。AY-FenR相对于室内敏感品系SCD和对照AY品系,对氰戊菊酯的抗性分别为3057和1945倍。AY-FenR品系交互抗性谱测定结果表明,相对于sCD和AY品系,对氯氰菊酯的抗性分别为19920和1441倍,对联苯菊酯的抗性分别为58和21倍,对多杀菌素的抗性分别为6和5倍,对溴虫腈的抗性分别为6和2倍,而对毒死蜱、甲维盐和氟虫腈并不存在交互抗性。用敏感品系SCD和AY-FenR进行正交、反交和回交,分析棉铃虫对氰戊菊酯的抗性遗传方式。正交和反交后代对氰戊菊酯的抗性水平相当,表现出469～628倍的抗性,显隐性度D值均处于0～1之间,表明棉铃虫对氰戊菊酯的抗性为常染色体、不完全显性遗传。回交后代BC的LD-P线在死亡率为50%处没有明显的平坡,进一步适合性检验不符合单基因遗传假设,从而证明棉铃虫对氰戊菊酯的抗性受多基因控制。3.棉铃虫对氰戊菊酯抗性的生化机理以及棉铃虫钠离子通道片段的克隆和序列比较在AY-FenR高抗品系中,增效剂PBO对氰戊菊酯的增效作用明显,增效比为114倍,而DEF和DEM在AY-FenR品系中对氰戊菊酯的增效作用分别为6和2倍。分别以三种不同底物测定多功能氧化酶的PNOD、ECOD和MROD活力,AY-FenR品系脂肪体PNOD活力是对照品系AY的2.1倍,中肠的PNOD活力分别是SCD和AY的2.1和4.9倍；AY-FenR脂肪体和中肠的ECOD活力分别是AY品系的30.3和3.4倍；AY-FenR脂肪体MROD活力分别是SCD和AY的2.3和11.5倍,均存在显著性差异,而AY-FenR中肠的MROD活力分别是SCD和AY的1.2和1.5倍,不存在显著性差异。酯酶活力在3个品系间差异均不显著。谷胱甘肽s-转移酶的活力,以CDNB为底物,AY-FenR品系的中肠和脂肪体活力分别是SCD的1.7和1.6倍,是AY的1.8和1.7倍,均不存在显著性差异；而以DCNB为底物,抗性品系AY-FenR的活力值比SCD和AY还要低。增效剂的增效作用测定结果和三种代谢酶的活力测定均证明,多功能氧化酶活性增强是棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的主要原因。通过RT-PCR扩增,获得编码棉铃虫钠离子通道α亚基I-IV结构域的cDNA片段,该片段长5536bp,编码1845个氨基酸。同源性分析表明棉铃虫钠离子通道α亚基与美洲棉铃虫的亲缘关系最近,氨基酸相似度高达98%。核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析结果表明,抗性和敏感品系中编码的氨基酸序列存在24处多态性位点,氰戊菊酯抗性品系棉铃虫钠离子通道基因不存在其它昆虫中报道的kdr和super-kdr抗性突变位点。但是无论在敏感品系还是抗性品系中均有可变剪接的现象,可变剪接出现在第17个外显子,其中两个氨基酸的差别形成了两种可变剪接体,但是这种情况在抗性和敏感体内均存在,因此与抗性相关的可能性较小。4.棉铃虫氰戊菊酯抗性品系近等基因系的建立将室内选育的棉铃虫对氰戊菊酯抗性品系AY-FenR和敏感品系SCD反复回交,回交后代用区分剂量杀死敏感纯合子及部分杂合子,经1代杂交、7代回交及1代自交,将棉铃虫抗氰戊菊酯基因导入敏感品系,构建了棉铃虫对氰戊菊酯的抗性近等基因系(SCD-FenR).为了提高该近等基因系的抗性倍数,继续筛选两代,目前对氰戊菊酯的抗性倍数为205倍。该品系除抗性目的基因及其紧密连锁区域外,其它遗传背景与敏感品系相同,为后续的相关研究提供了重要的实验材料。