【背景】　　1.多溴联苯醚（PBDEs）的特性：多溴联苯醚(PBDEs)是一种工业的化学物，也是一种环境污染物，常作为阻燃剂用于建筑材料、电子产品及纺织品中。我国作为塑料制品、纺织品、电路板生产加工的大国，生产、使用居世界首位,在我国一些地区已形成了电子垃圾拆解集散地,使PBDEs等持久性有毒污染物不断向周围释放,严重污染了当地环境,危害人体健康。　　由于PBDEs能够通过食物链转移，有生物放大效应，进而影响人体健康。研究表明，环境中的多溴联苯醚正不断以指数形式增长,PBDEs在环境中稳定性好,可在水体、土壤和底泥等环境介质中存留数年,也可沿着食物链传播,最终经大气、室尘、食物、母乳等蓄积于人体内。众多研究发现多溴联苯醚的生态毒理学效应包括对生物体内酶系统活力的影响；对生物体生殖系统、甲状腺、神经系统以及免疫系统的影响；可能有致畸、致癌和致突变作用，因此，在一些发达国家，低溴类如BDE-47,99,153等已限制生产和使用，但高溴类PBDEs如BDE-208，BDE-209等因阻燃性能好，成本低而仍在广泛使用。我国广东珠三角地区PBDEs主要类型是十溴联苯醚。　　2.十溴联苯醚(BDE-209)的特性：十溴联苯醚（BDE-209）是我国使用量最大的一种溴代阻燃剂，主要用于与人们日常生活直接相关的各种产品中，如家用电器、塑料、布料等易燃物品中。由于用量较大，BDE-209环境污染的持续增加导致其成为我国人群中最主要的多溴联苯醚暴露类型，在人类的精液、脐血以及胎盘中均检测到了BDE-209，证实了BDE-209围产期暴露的严峻现状。由于神经发育毒性可导致学习与记忆力障碍，妊娠期 BDE-209暴露后大鼠子代的脑组织中可以检测到BDE-209，证实围产期BDE-209暴露可以直接作用于子代的神经系统发育。动物实验研究发现围产期BDE-209暴露后，其子代学习及记忆能力显著地下降。人类流行病学研究发现出生前和哺乳期BDE-209暴露与婴儿神经系统发育尤其是学习与记忆能力发育呈负相关。既往研究发现，BDE-209暴露可以引起神经干细胞的增殖能力下降、凋亡增加，可以影响神经递质的分泌，揭示了BDE-209的急性神经毒性的初步机制，但并不能充分解释围产期BDE-209暴露可导致子代成年后学习记忆能力下降这种远期效应的产生，所以研究BDE-209的作用机制，确定作用的关键环节，可以为进一步阐明BDE-209宫内暴露对胎儿的神经发育毒性提供新研究思路，为国家制定相关政策提供理论依据。　　3.神经干细胞(NSCs)分化的表观遗传调控：过去研究已经证实，大脑中重要结构海马与学习记忆关系密切。而在胚胎期直至成年大脑中一直存在的神经干细胞为学习记忆机制的研究提供了一个新的视点。哺乳动物胚胎期，神经干细胞主要分布于海马、纹状体、大脑皮质、中脑等区域。哺乳动物脑内在侧脑室室管膜下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下区(SGZ)两个部位终生存在神经干细胞，这些 NSC可增殖分裂产生新的神经元，并整合到局部神经环路中，参与学习记忆过程。在大脑发育过程中，神经干细胞可分化为神经元和胶质细胞，但是分子机制尚未完全清楚。越来越多的研究表明,神经干细胞的分化能力与其表观遗传修饰状态有关。作为重要的表观遗传学现象之一,DNA的甲基化对基因的表达调控的形成起着重要的作用。DNA甲基转移酶（Dnmt）可催化和维持DNA甲基化过程。最新的研究表明氧化应激参与了基因组DNA甲基化水平的调控。氧化应激可以引起细胞内活性氧自由基（ROS）水平的升高以及激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应，进而影响细胞增殖凋亡等多种生物学行为。已有研究显示氧化应激水平增加与 DNA甲基化转移酶的表达水平下调有关，参与DNA甲基化的调控，从而参与神经发育及神经干细胞的分化能力的调控，DNA甲基化水平的降低可以改变神经干细胞的分化能力。环境因素可以影响暴露细胞的DNA的甲基化状态。有机氯农药、甲基汞等可以降低肝细胞的DNA甲基化程度。　　前期研究发现孕期BDE-209暴露会降低子鼠海马NSCs分化能力，使NSC向神经元的分化能力下降，而向神经胶质细胞的分化增加；这个发现提示我们神经干细胞分化能力可能是BDE-209神经毒性的关键靶点之一。胆碱能神经元在记忆、认知功能以及海马神经发生方面具有重要作用。研究发现BDE-209围产期暴露后，子代大鼠海马组织乙酰胆碱脂酶及乙酰胆碱活性明显下降。Johansson等发现BDE-209新生期暴露可引起成年小鼠胆碱能受体下调,胆碱能敏感性下降并随着年龄恶化。由此可见,BDE-209可以影响神经干细胞的分化能力尤其是向胆碱能神经元分化的能力可能是其影响学习记忆能力的关键。　　本次主要研究BDE-209暴露对神经干细胞分化、氧化应激、DNA甲基化及蛋白磷酸化表达的影响,探讨BDE-209对神经干细胞毒性机制，分别体外培养海马NSCs，经BDE-209暴露后观察NSCs分化的形态,检测NSCs暴露后向胆碱能神经元分化的比例，BDE-209暴露后NSCs氧化应激改变及暴露后甲基化、蛋白磷酸化水平的变化，整个研究分四个部分进行。　　第一部分 BDE-209对体外培养神经干细胞分化的影响　　【目的】取大鼠海马组织进行体外细胞培养，研究十溴联苯醚对NSCs分化的影响。　　【材料与方法】　　1.购买新生1天的SD大鼠，取其海马组织在无血清培养基中进行神经干细胞培养。　　2.取培养3-4代后海马神经干细胞继续进行NSCs鉴定。　　3.取培养3-4代的新生鼠海马NSCs，在含不同浓度的BDE-209血清培养基中分化培养，实验共分5组，空白对照组（BC）,DMSO对照组(VC)，实验A组：BDE-209浓度为10nM,实验B组：BDE-209浓度为100nM,实验C组：BDE-209浓度为1000nM。每组设6个平行样。　　4.分化培养7天后行免疫荧光的检测，运用美国Image-Pro-Plus6.0图象处理软件记数CHAT阳性,GFAP阳性,DAPI阳性细胞数目,计算CHAT+/DAPI+，GFAP+/ DAPI+比例。　　【结果】　　1.海马NSCs培养3-4代后，在倒置显微镜下可见许多由数十到数百个细胞聚集成大小不同的神经球，神经球折光性强，免疫荧光检测证实为神经干细胞。　　2.吹打成单细胞悬液后在含血清培养基中培养后发现细胞长出突起，并形成网状，经细胞免疫检测后发现暴露于BDE-209后CHAT+/DAPI细胞比例下降，GFAP+/DAPI细胞比例增加。　　【结论】分离培养的形成悬浮生长的神经球是由数十到数百个神经干细胞聚集而成， BDE-209可导致神经干细胞分化成胆碱能神经元的比例下降，分化成胶质细胞比例增多。　　第二部分BDE-209对体外培养神经干细胞活性氧及氧化应激基因的影响　　【目的】检测不同浓度BDE-209对体外培养新生鼠NSCs活性氧及氧化应激基因的影响。　　【材料与方法】　　1.取传代培养3-4代的新生鼠海马NSCs暴露于不同浓度的BDE-20972小时，实验共分5组,空白对照组（BC）,DMSO对照组(VC)，实验A组：BDE-209浓度为10nM,实验B组：BDE-209浓度为100nM,实验C组：BDE-209浓度为1000nM。每组设6个平行样。　　2.用carboxy-H2DCFDA染色检测NSCs暴露BDE-209后活性氧的水平。　　3．经qRT-PCR分别测定氧化应激基因SOD2，LDHA，HIF1A，HIF2A的mRNA表达情况。　　4.绘制氧化应激基因的扩增曲线及溶解曲线，进行统计学分析。　　【结果】结果显示细胞暴露于不同浓度BDE-209后，ROS产生增多，qRT-PCR结果显示SOD mRNA表达下调，LDHA，HIF1α，HIF2α mRNA表达上调。　　【结论】BDE-209可以导致神经干细胞ROS产生增多,可以导致氧化应激基因表达异常，从而影响神经干细胞的分化能力，这可能是BDE-209神经毒性的作用机制之一。　　第三部分 BDE-209对体外培养神经干细胞DNA甲基化的影响　　【目的】探讨不同浓度的BDE-209对体外培养新生鼠海马NSCs DNA甲基化的影响。　　【材料与方法】　　1.传代培养NSCs，取第3-4代的神经干细胞，暴露于不同浓度的BDE-209的培养基后72小时，分5组进行实验， DMSO对照组(VC)，空白对照组（BC）,实验A组：BDE-209浓度为10nM,实验B组：BDE-209浓度为100nM,实验C组：BDE-209浓度为1000nM。每组设6个平行样。　　2.经qRT-PCR分别测定各组基因DNMT1，DNMT3a，DNMT3b的mRNA表达情况，经Western Blotting分别测定DNMT1，DNMT3a，DNMT3b蛋白表达情况，采用MethylFlash?Methylated DNAQuantification Kit检测各组DNA总甲基化水平。　　3.qRT-PCR绘制基因溶解曲线及扩增曲线，对DNA的总甲基化，DNMT1，DNMT3a，DNMT3b基因的mRNA及蛋白表达水平进行统计分析。　　【结果】不同浓度的BDE-209作用72 h后,可致神经干细胞总甲基化水平下降，甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a,DNMT3b基因及蛋白表达下降。　　【结论】BDE-209可以导致神经干细胞总甲基化水平下降，可能与BDE-209导致神经干细胞甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a,DNMT3b基因及蛋白表达下降有关。　　第四部分 BDE-209对体外培养神经干细胞p-ERK1/2、p-JNK1/2、NF-kB蛋白表达的研究　　【目的】观察BDE-209对海马神经干细胞ERK1/2磷酸化、JNK1/2磷酸化，NF-kB表达的影响。　　【材料与方法】　　1.取传代培养3-4代的新生鼠海马神经干细胞，在不同浓度BDE-209的培养基中培养72小时，实验共分5组，空白对照组（BC）,DMSO对照组(VC)，实验A组：BDE-209浓度为10nM,实验B组：BDE-209浓度为100nM,实验C组：BDE-209浓度为1000nM。每组设6个平行样。　　2.经Western Blotting分别测定p-ERK1/2，p-JNK1/2，NF-kB蛋白表达情况　　【结果】不同浓度的BDE-209作用72 h后, p-ERK1/2，p-JNK1/2表达未见明显异常，NF-kB蛋白表达增加，与对照组相比差异均有显著意义。　　【结论】BDE-209在一定剂量和作用时间内可致海马神经干细胞的NF-kB蛋白表达增加， p-ERK1/2，p-JNK1/2表达未见明显改变。推测BDE-209在一定浓度范围内可能通过NF-kB信号通路导致神经干细胞发生异常改变，这可能是导致仔鼠学习记忆能力下降的作用机制之一。