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烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物之一,但我国烟草育种面临亲本匮乏、品种遗传背景狭窄、盲目性、重复性大等问题。SNP标记被广泛应用于作物种质资源的亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助选择等方面。高通量转录组测序为SNP标记的开发提供了大量信息,但在烟草中的应用鲜有报道。因此,本研究基于烟草转录组测序获得的大量unigenes,利用生物信息学方法鉴定出大量SNPs,进而根据SNP位点信息开发AS-PCR和KASP标记,并应用于烟草种质遗传多样性分析和种质的指纹图谱构建。具体研究结果如下:1.采用高通量Illumina HiSeqTM对10个烟草材料进行转录组测序,共获得108.04G Clean bases,平均每个样本10.084G。将reads比对到参考基因组上进行SNP calling,共获得SNP位点121416个。其中,转换型SNP有78236个,占比64.4%,颠换型SNP有42842,占比35.3%,二者之比为1.83:1。转换型中,C->T略多,而G->T在颠换型中占多数。2.采用AS-PCR、ARMS-PCR和KASP三种方法进行SNP检测,结果表明:AS-PCR和KASP都能有效地检测出SNP,重复性好、稳定性强。对AS-PCR反应条件进行优化,最优PCR反应体系为:5 ul 2×Taq MasterMixⅡ、FA/FB引物各0.25ul、DNA 30 ng,ddH2O补足至10ul。最优的PCR扩增程序为:95℃预变性3min、95℃变性30s、最佳退火温度下退火30s、72℃延伸1min、35个循环、72℃延伸5min。3.设计265对AS-PCR引物和30组KASP引物,运用优化的AS-PCR反应条件和KASP技术同时对30个SNP位点进行检测。开发了46对AS-PCR标记,其中42对多态性能检测出8个多态性SNP;开发了11组KASP标记,能检测出11个多态性SNP。因此,表明KASP技术的检测效率更高,但相对于AS-PCR,KASP技术成本高,所需仪器较复杂,耗时也相对较长。4.利用NCBI数据库中的ORF finder预测其11个SNP位点序列的开放阅读框。结果显示:11个SNP位点中,S368位于5’UTR区,S382位于3’UTR区,其他9个位点位于编码区,其中6个SNP的变化会造成错义突变。根据转录组数据中的GO注释和KEGG富集分析,发现11个多态性SNP位点基因的功能涉及到氰胺酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、次生代谢产物的生物合成、苯丙烷生物合成、植物病原-互作等生物过程。5.开发的16组SNP引物在94份烟草材料中共检测到22个不同的等位基因位点,多态信息含量PIC值范围在0.022-0.375,PIC平均值为0.287。94份烟草材料的遗传相似性系数在0.22-1.00之间,遗传多样性丰富。在相似性系数为0.73时,可将94份烟草材料分为四大类;相似性系数为1.00时,可将94份烟草材料分为34类。11个多态性SNP标记能将24份烟草材料区分开。利用11个多态性SNP标记构建了34份烟草种质的指纹图谱。