血管性血友病因子(VWF)是存在于血浆中的一种重要的止血相关蛋白,主要由血管内皮细胞和巨核细胞/血小板合成和分泌,在初期止血和二期止血中均发挥重要作用。VWF在血浆中是以多聚体的形式存在的,其分子量介于500~20,000kDa之间。同时,VWF与血小板的粘附活性直接与其多聚体的分子量大小成正相关。VWF多聚体分子量的大小则主要由血浆中的一种称为ADAMTS13的金属蛋白酶来调节的,它是通过剪切VWF-A2功能域内的Tyr1605-Met1606之间的肽腱而实现的。VWF多聚体的这一生理性水解受到多种因素的影响或调控,如VWF空间构象、流体剪切力、ABO血型、血浆酸碱度和部分二价阳离子等。同时,某些病理因素或状态亦会影响到ADAMTS13对VWF的水解活性,如ADAMTS13自身抗体、ADAMTS13或VWF基因缺陷以及ADAMTS13或VWF的基因多态性等。其中有两种相反的病理状态均具有重要的临床意义:ADAMTS13自身抗体或基因缺陷导致其酶活性的明显降低或缺乏,从而在临床上发生特发性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP);而VWF的某些基因缺陷则导致VWF对ADAMTS13异常敏感而被ADAMTS13过度水解,即2A型和2B型血管性血友病(VWD)。本文围绕ADAMTS13对VWF酶解的相关影响因素进行了研究,包括三部分内容:(1)分别观察了抗人VWF不同功能域的八种鼠源性单克隆抗体(单抗)在高剪切力和静态条件下对ADAMTS13依赖性VWF水解活性的影响,并对其中的一株抗VWF单抗—SZ34进行了抗原表位的鉴定(。2)观察了一种2A型VWD突变—A1500E对突变体VWF的ADAMTS13依赖性水解的敏感性的影响。(3)发现一例遗传性TTP病例,经基因测序证实为ADAMTS13富半胱氨酸区存在一种新的突变类型—R498C,并应用分子克隆技术对此突变对ADAMTS13酶活性的影响进行了体外研究。一、抗VWF单克隆抗体对ADAMTS13水解VWF活性的影响研究发现多种因素可以通过与VWF的结合而影响ADAMTS13介导的VWF水解。其中,能够分别与VWF-A1区和D’D3区结合的血小板和因子VIII均能在流体剪切力条件下促进ADAMTS13对VWF多聚体的裂解。与此相反,血小板敏感蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP-1)则通过与ADAMTS13竞争性结合VWF-A3区而抑制ADAMTS13对VWF的水解活性。为了探讨抗VWF单抗是否可以通过与VWF的结合而影响ADAMTS13对VWF的水解活性,本研究应用了针对人VWF不同功能域的八种鼠源性单抗进行了相关研究,它们分别是1C1E7和75H4B12(抗VWF-D’D3区),SZ129和SZ130(抗VWF-A1区),SZ29和SZ34(抗VWF-A2区)和SZ123和SZ125(抗VWF-A3区)。分别观察了不同浓度的各种抗VWF单抗在高剪切力条件下和静态条件下对ADAMTS13酶解VWF活性是否具有影响作用。另外,对其中一种能够在高剪切力条件下抑制ADAMTS13对VWF水解活性的抗VWF-A2区单抗(SZ34)进行了抗原表位的鉴定。首先,将不同浓度的抗VWF单抗分别与纯化的血浆源VWF(pVWF)进行孵育,再加入重组ADAMTS13(rADAMTS13),然后置于微型涡旋器(mini vortexer)上,以2500rpm涡旋5分钟,最后进行VWF多聚体电泳、非还原SDS-PAGE和Western blot分析,判定在高剪切力条件下抗VWF单抗对ADAMTS13水解VWF活性的影响。结果显示SZ34在高剪切力条件下对ADAMTS13裂解VWF的活性具有明显抑制作用,并且呈剂量依赖性抑制。而其它几种抗VWF单抗在高剪切力条件下对ADAMTS13水解VWF的活性均无影响作用。其次,将pVWF用盐酸胍进行预变性后与不同浓度的抗VWF单抗孵育,然后再加入rADAMTS13进行酶切,以此来判定在静态/变性条件下抗VWF单抗对ADAMTS13水解VWF活性的影响。结果显示,包括SZ34在内的八种抗VWF单抗在静态/变性条件下对ADAMTS13水解VWF的活性均无影响。另外,我们还在不加入尿素或盐酸胍等变性剂的条件下直接观察了SZ34对ADAMTS13依赖性R1597W突变体VWF的水解的影响,结果显示SZ34在静态/非变性条件下对VWF水解亦无影响。最后,应用VWF的多种相关蛋白对SZ34进行了抗原表位的鉴定。除了pVWF为直接应用人凝血因子Ⅷ浓缩物纯化得到外,其他均为包含VWF不同功能域或结构的重组蛋白,包括D’D3(S764P1247-H)、A1A2A3(Q1238G1874-H)、A1(H-E1260P1467)、A2(H-G1481R1668)、A3(S1681R1877-H)、A2-12(GST-D1459G1595-H)、A2-23( VWF114 , GST-A1555R1668-H )、A2-1 ( GST-D1459E1554-H )、A2-2(GST-A1555G1595-H)和A2-3(VWF73,GST-D1596R1668-H)等。应用VWF的这些相关蛋白通过酶联免疫吸附实验(ELISA)联合Western blot等技术对SZ34的抗原表位进行了鉴定。结果表明SZ34为一种构象特异性抗VWF单抗,其抗原表位位于VWF蛋白A2功能域的A1555-G1595片段内。这些结果提示VWF-A2功能域内的A1555-G1595区段可能部分或全部呈构成性暴露于自然状态的VWF表面,并在ADAMTS13依赖性VWF水解过程中发挥重要的作用。二、VWF蛋白A1500E突变对其ADAMTS13依赖性水解的敏感性的影响研究发现VWF的突变可以导致ADAMTS13依赖性VWF水解敏感性的改变,这包括2A型和2B型VWD突变。其中,2A型突变在发病机制方面分为两组突变类型。第一组突变引起VWF多聚体在内质网和高尔基体之间的转运和分泌障碍;第二组突变则不影响VWF多聚体的合成和分泌,但其VWF多聚体对血浆中的某种蛋白水解酶即ADAMTS13异常敏感而被过度水解。为了探讨VWF蛋白A1500E突变体对金属蛋白酶ADAMTS13依赖性水解的敏感性的改变,为VWF-A1500E突变导致2A型VWD的发病机制提供直接依据,在前期相关工作的基础上将野生型VWF质粒和A1500E突变体VWF质粒分别瞬时转染Hela细胞,收集并浓缩培养上清,分别用重组人ADAMTS13进行水解,然后通过SDS-琼脂糖凝胶电泳进行VWF多聚体分析,观察与野生型VWF相比,A1500E突变体VWF对ADAMTS13的敏感性有无改变。结果显示在无尿素和盐酸胍等变性剂的静态条件下,rADAMTS13即可对A1500E突变体VWF进行有效的水解,即VWF多聚体分析显示大中分子量VWF多聚体明显减少和小分子量VWF多聚体明显增多;相反,野生型VWF在非变性条件下则缺乏被rADAMTS13水解的证据。上述结果表明A1500E突变导致突变体VWF对ADAMTS13的敏感性异常性增高,符合第二组2A型VWD的突变特点。三、ADAMTS13富半胱氨酸域R498C突变的分子机制研究TTP至少可以分为遗传性、特发性和继发性三种临床类型。研究证实,绝大多数遗传性TTP的ADAMTS13活性严重降低(多<10%),主要是由于ADAMTS13的基因突变所导致的。ADAMTS13基因突变没有“热点”区域,广泛分布在ADAMTS13的9个结构域的外显子和部分内含子中,50%以上的突变为错义突变,其余有移码突变、无义突变、剪接异常和碱基缺失等。本章节对于一例在妊娠期发作的女性TTP患者进行了分子发病机制的研究。首先,应用尿素变性条件下的VWF水解结合VWF多聚体电泳的方法测定了血浆ADAMTS13活性,结果提示患者血浆ADAMTS13酶活性缺如,且不存在抗ADAMTS13自身抗体。随后,从患者的白细胞中抽提基因组DNA,然后对ADAMTS13基因的所有29个外显子(包括内含子和外显子交界区序列)进行扩增和DNA测序,结果显示ADAMTS13基因的第13号外显子的1492位核苷酸序列由C突变为T,从而造成ADAMTS13蛋白富半胱氨酸域498位氨基酸由精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys),并且在正常人群没有发现此多态性。此突变为ADAMTS13的一种新的突变类型,在国际上尚无报道。接着,又采用基因重组和体外定点突变技术,构建了ADAMTS13-R498C突变体。最后,将野生型和突变体ADAMTS13质粒分别转染Hela细胞进行体外表达,Western blot分析提示细胞裂解液中ADAMTS13蛋白表达量正常,但细胞上清中ADAMTS13蛋白完全缺失。同时,通过免疫荧光定位技术证实R498C突变体的ADAMTS13在内质网和高尔基体中的分布和含量正常,提示R498C突变并未影响到ADAMTS13的合成和细胞内转运,但造成其向细胞外的分泌异常,从而导致该突变蛋白在细胞外的缺失。