【摘 要】
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目的:为了明确独脚金内酯信号传递关键基因MAX2基因在瓜列当识别独脚金内酯过程中的功能,进一步了解独脚金内酯信号传递机制,为利用独脚金内酯信号传递途径防治列当提供理论依据。bem方法:通过RT-PCR方法对列当感知独脚金内酯基因MAX2进行的克隆,命名为PaMAX2。采用生物信息学软件预测该基因蛋白的特性。选取PaMAX2基因的特异性片段,构建反向重复序列的植物沉默载体和该基因的过表达载体,并且通
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目的:为了明确独脚金内酯信号传递关键基因MAX2基因在瓜列当识别独脚金内酯过程中的功能,进一步了解独脚金内酯信号传递机制,为利用独脚金内酯信号传递途径防治列当提供理论依据。bem方法:通过RT-PCR方法对列当感知独脚金内酯基因MAX2进行的克隆,命名为PaMAX2。采用生物信息学软件预测该基因蛋白的特性。选取PaMAX2基因的特异性片段,构建反向重复序列的植物沉默载体和该基因的过表达载体,并且通过组织培养建立了瓜列当的再生体系。用农杆菌遗传转化法将载体转化到列当愈伤组织中,获得RNAi植株和过表达愈伤组织。最后对转化成功的RNAi植株和过表达植株的寄生率进行统计,并用q PCR检测该基因在转基因植株中的表达量,分析PaMAX2基因的功能。结果:1.通过RT-PCR的方法克隆到瓜列当PaMAX2基因为2130bp。在NCBI中对比后,该基因与瓜列当MAX2基因序列一致性达到98.97%、登陆Prot Param分析氨基酸理化性质,PaMAX2的分子式为C6817H11368N2268O2817S581,分子量为189.67KD,等电点PI值为4.87,弱酸性。所编码709个氨基酸,脂肪系数21.87,为不稳定疏水蛋白（不稳定系数,instability index=44.21;GRAVY=0.744）。使用SPOMA在线工具预测PaMAX2蛋白二级结构,预测结果显示该蛋白中333个氨基酸形成α螺旋最多,占比44.21%;282个氨基酸形成无规则卷曲,占比39.83%;有86条扩展链,占比12.15%。2.以瓜列当种子萌发刺激物GR24处理4天后的列当种子作为外植体,并且使用不同培养基以及不同激素和不同蔗糖浓度诱导愈伤组织,诱导出列当花芽的最佳培基为B5培养基,其组成成分为B5+3%蔗糖+600mg/L酸水解酪蛋白+0.7%琼脂。研究发现蔗糖含量对放瓜列当的发育影响较大,相同条件下,3%蔗糖诱导出的花芽数量更多。同时在组织培养过程中发现,在没有寄主的条件下,列当存在相互寄生的现象。3.列当愈伤组织进行农杆菌转化,经过抗生素的抗性筛选和PCR分子验证,成功获得转基因愈伤组织。在非转基因列当中,使用组织培养花芽状态的列当去接种甜瓜（高感列当甜瓜品种-益丰那西甘）,其寄生率为8%。经过农杆菌侵染后,愈伤组织寄生率普遍降低。这一现象是由于瓜列当愈伤组织本身的寄生能力就较弱,及经过农杆菌侵染后,能够继续生长的愈伤组织较少所造成的。p XQ35-PaMAX2 RNAi-MSU440转入瓜列当后,寄生率相对于只用农杆菌MSU440对照降低,通过寄生率和PaMAX2基因在p XQ35-PaMAX2 RNAi-MSU440和p XQ35-PAMAX2-MSU440植株中的表达量可以分析得出,该基因在当感知独脚金内酯的信号传递过程中有着重要的作用,它通过影响愈伤组织是否能够感知得到感知独脚金内酯,对列当的寄生率也有一定的影响。
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